Диссертация (1151583), страница 14
Текст из файла (страница 14)
1 – Схема морфофункциональных исследованийАнатомические исследования. Животных взвешивали после убоя иобескровливания, вскрывали брюшную полость, проводили визуальныйосмотр органов на наличие патологий, затем проводили топографические74исследования селезѐнки: голо-, скелето- и синтопию. Селезѐнку извлекали иосвобождали от связок, жировой ткани. Форму определяли с помощьюконтрастных отпечатков на миллиметровой бумаге. Абсолютную массуселезѐнки находили взвешиванием на ЭЛВТ-200 (цена деления 0,001 г),относительную массу определяли отношением органа к массе телаживотного в процентах.
Линейные показатели длины, ширины, толщиныоргана измеряли штангенциркулем с ценой деления 0,01мм.Сцельюглубокогоисследованияанатомо-топографическихособенностей селезѐнки проводили поперечные распилы трупов животныхпо Н.И. Пирогову. Для этого трупы фиксировали в естественном положении,помещали в холодильную камеру и замораживали при –20°С в течение пятидней (до плотности дерева). Трупы извлекали из камеры и сразу проводилираспилы мелкозубчатым двухсторонним полотном по металлу, начиная сдевятого грудного позвонка до четвертого – поясничного, поочередно, черезкаждые два позвонка. На пластинах выявляли синтопию селезѐнки ифотографировали.Кровеносные сосуды селезѐнки изучали методом коррозии, при этомих инъекцию осуществляли раствором измельчѐнного прессованноготоварного целлоидина в ацетоне.
Для инъекции артериальных сосудовиспользовали растворы 10%-ной, а венозных – 30%-ной концентраций.Сосуды селезѐнки мелких животных (в связи с малым диаметром сосудов)инъецировали через чревную артерию. Инъекцию селезѐночной веныосуществляли в области еѐ отделения от воротной вены с помощью шприца(ѐмкостью 20 мл) или шприца «Жане» (ѐмкостью 250 мл при крупномдиаметре сосуда) и катетера, которым вводили раствор целлоидина,подкрашенноговыдерживалиметиленовой24часавсинью.холоднойИнъецированныеводе,затемпрепаратыпогружаливконцентрированную техническую соляную кислоту до полного разрушениятканей органа (от 3 до 5 дней).
После коррозии препарат извлекали из75кислоты и промывали под слабой струей проточной воды, затем высушивалипри комнатной температуре и фотографировали.Инъекцию сосудов латексом осуществляли через чревную артерию – умелких животных и непосредственно в селезѐночную артерию – у крупных, спомощью инструментария, аналогичного методу коррозии. Предварительно вартерии и вены вводили чистую теплую (40°С) воду, после чегоинъецировали латексом. При заполнении венозных сосудов на нихнакладывали лигатуры.Инъекцию венозных сосудов органа проводили через селезѐночнуювену, степень заполнения сосудов контролировали по наполнению мелкихартерий и вен, в момент выхода латекса из них накладывали лигатуры, накрупные сосуды – зажим «Кохера».
Инъецированный препарат помещали напять дней в 3%-ный раствор формалина и в течение 15 дней постепеннодоводили его концентрацию до 15%. Экстра- и интраорганные сосудыселезѐнки исследовали методами тонкого препарирования по В.П. Воробьеву(1958). Внутренний диаметр крупных артерий и вен измеряли при помощицифрового штангенциркуля с ценой деления 0,01 мм, мелких – окулярнойлинейкой микроскопа МБС–9.Длярентгеноангиографическогоисследованияприменялирентгеноконтрастный состав для наливки кровеносных сосудов на основесвинцового сурика (Ильгеев С.Т., Тайгузин Р.Ш., Жанабеков У.М.
и др.,1989), а также смеси сернокислого бария и латекса. После инъекции сосудовселезѐнки проводили рентгенографию на аппарате РУМ-4 при экспозиции0,15–10,0с и напряжении тока 45 – 71 кВт. Фотографирование препаратов – спомощью цифровой фотокамеры «Nicon».Гистологические исследования.Материалом для исследованиягистоархитектоники селезѐнки служили гистологические образцы (0,05–1,0см³) органа животных. Для изучения гисто- и ангиоархитектоникиселезѐнки гистопробы отбирали в различной проекции в области ворот - спариетальной и висцеральной поверхности, с захватом капсулы, и в76срединной части органа.
Гистологический материал фиксировали в 10%-номрастворе нейтрального формалина или в специальном молекулярномрастворе, после стандартной гистологической обработки (проводка черезбатарею спиртов возрастающей крепости) заливали в целлоидин-парафин.Полученные гистосрезы, толщиной 5 – 6 мкм, окрашивали гематоксилиномМайераиэозином,поРомановскому-Гимза,углеводсодержащиебиополимеры выявляли по Хочкису (Hotchkiss R.D., 1948), визуализациюРНК ядрышек и цитоплазмы – по методу Браше (Саркисов Д.С., ПеровЮ.Л., 1996). Световую микроскопию выполняли при помощи микроскопаMicros MSD500 (Австрия), оснащенного цифровой камерой.При проведении гистохимических реакций нами проведена следующаяметодика: на предметные стекла наклеивали серию парафин-целлоидиновыхсрезовобразцов тканиселезѐнки, взятыхот разныхживотныхиодномоментно, в соответствии с методикой стѐкла погружали в растворы.Цитологические исследования.
Пробы селезѐнки (0,025 см3 – дляизготовления ультратонких срезов) фиксировали в охлажденном 2,5%-номрастворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4). Послеобщепринятой подготовки и дегидратации материала пробы помещали всмесьэпон-аралдит.Полутонкиесрезытолщиной0,07–0,008мкмизготавливали на ультратоме LKB V (Швеция), окраску, которых проводили1,0% раствором толуидинового синего, приготовленного на 2,5%-нойбезводной соде. Электронную микроскопию производили на электронноммикроскопе JEM-7A (Япония).Морфометрическиеисследования.Выполнялидляполученияколичественной информации о линейных размерах, диаметрах лимфоидныхструктур селезѐнки, еѐ экстра- и интраорганных сосудов ГМЦР, а также осоотношениях площадей структурных компонентов, использовали винтовойокуляр-микрометр МОВ-1-15х1500 (ГОСТ 15150-69) и лицензионнуюпрограмму «Тест Морфо-4.0».
Гистостереометрические исследования поудельным площадям гистологических структур проводили с помощью77окулярных вставок: контрольных точек для работы по исчислению объемаструктур, измерительных линеек. В отдельном образце ткани измерениекаждого показателя осуществляли не менее чем в 16 полях зрения каждогообъекта(АвтандиловГ.Г.,1990).Лимфоидныеузелкиселезѐнкиклассифицировали по диаметру: крупный – от 500 мкм и выше, средний – от200 до 500 мкм, мелкий – до 200 мкм.Гематологическиеисследованияпроводилипоследующимпоказателям и методикам: количество гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов– гематологическим анализатором Medonic СА 620.
Прибор используется дляизмерения гемоглобина – колориметрический метод, а для подсчета клеток иопределения их размеров – кондуктометрический метод. Дифференциальныйподсчет лейкоцитов (гранулоциты и агранулоциты) – в окрашенных мазкахкрови по Романовскому-Гимзе (Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г.и др., 1985).Биохимические исследования крови: общий белок сыворотки кровиисследовалипотурбидиметрическибиуретовойреакции,белковые(фотоэлектроколориметр).фракцииАктивность–щелочнойфосфатазы – спектрофотометрированием с помощью набора реактивовЛахема-диагностика.Концентрациюглюкозы–спомощьюнабора«ГЛЮКОЗА-ФКД» (фотоэлектроколориметр).
Определение концентрациикальция в сыворотке крови – комплексометрическим методом с индикаторомфлуорексоном, концентрации фосфора – в безбелковом фильтрате крови сванадат-молибденовымреактивом(поПулсувмодификацииВ.Ф.Коромыслова и Л.А. Кудрявцевой). Активность АсАТ и АлАТ в сывороткекрови–динитрофенилгидразиновымметодом(Райтман,Френкель)(Кондрахин И.П., 1985). Коэффициент де Ритиса (используемый длядифференциальной диагностики) вычисляли исходя из соотношения: АсАТ /АлАТ (Медведева М.А., 2008).Определение концентрации гормонов в сыворотке крови: кортизолаидигидроэпиандростерона-сульфат(ДГЭА-С)78осуществлялиметодомтвердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на спектрофотометре«Multiscan Labsystems» (Финляндия), с использованием стандартных наборовреагентов: для кортизола – «ИФА-кортизол», для ДГЭА-С – «ИммуноФАДГЭА-С» (Москва).Статистическая обработка.
При помощи программы «Microsoft OffiseExcel» на персональных компьютерах Intel Celeron D и компьютере AMDAthlon (tm) XP 1800+ в операционной среде Windows XR Professional, всеполученныеколичественныепараметрыподвергаливариационно-статистической обработке: вычисление средней величины, вероятность ееошибки – по t-критерию достоверности Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).,выявленные взаимовлияния показателей гистоструктур селезѐнки – черезкоэффициенты парной корреляции (Автандилов Г.Г., 2002).Приготовлениегистопрепаратов,исследованиегистоструктурыселезѐнки, морфометрию ее структур, статистическуя обработку полученныхданных и их корреляционный анализ проводили в условиях кафедрыморфологии, физиологии и патологии ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ».ПолучениеультратонкихосуществлялинабазесрезовилабораторииихэлектроннуюэлектронноймикроскопиюмикроскопииФГУ«Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Росздрава» (г.
Уфа);биохимическийиморфологическийанализкровипроводиливгематологической лаборатории ВНИИМС РАСХН. Концентрации гормоновопределяли на базе лаборатории института клеточного и внеклеточногосимбиоза Уральского отделения РАН.Названияанатомических,гистологическихиэмбриологическихструктур и образований приведены в соответствии с Международной(Парижской) анатомической и гистологической номенклатурой (N.A.V.,N.H., N.E.V., 1994), уточненной на международных конгрессах, русскиеэквиваленты–по4-йредакцииМеждународнойветеринарнойанатомической номенклатуры (Удовин Г.М., 1979; Зеленевский Н.В., 2003).79Все процедуры с животными в эксперименте проводили в соответствиис протоколами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных,используемых для экспериментальных и других научных целей» (EuropeanCommunities Council Directive (86/609/EEC), с требованиями нормативныхправовыхактов,регламентирующихвыполнениеиcследованийпобезопасности и эффективности фармакологических веществ в РФ (ПриказМЗ РФ «Об утверждении правил лабораторной практики» №267 от19.06.2003 г.), и законодательством Российской Федерации (Национальныйстандарт ГОСТ Р 53434-2009).803 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1СравнительнаяморфологияитопографияселезѐнкимлекопитающихСравнительнаяхарактеристикаморфометрическихпараметровселезѐнки различных видов домашних и диких млекопитающих даетпредставление о функционировании органа в зависимости от строенияорганизма, среды обитания, нарушения технологических норм содержания,изменений, обусловленных, в ряде случаев, воздействием техногенныхфакторов; до настоящего времени данный вопрос изучен недостаточно.В связи с этим актуально изучение топографии, массы, формы иморфометрии органа как основных морфологических критериев оценки егосостояния.Исследования морфологии селезѐнки домашних и диких животныхразных семейств, родов и видов выявили следующее: селезѐнка лошади (лат.Equus ferus caballus) встречается в двух формах: первая – со стороныоснования по направлению к верхушке постепенно суживается, принимаясерповидно-треугольную форму.АБРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
