Диссертация (1151325), страница 20
Текст из файла (страница 20)
О РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ:КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ДНК С ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ (in silico)2.3.3.1. Молекулярная динамика и свободная энергия связываниялинолевой кислоты с ДНК в водном раствореСтроение комплексов олигонуклеотида и линолевой кислотыПосле оптимизации комплекса линолевой кислоты (EIC) и ДНК(dA)25·(T)25 (рис. 12, А) количество межатомных взаимодействий ‒ ван-дерваальсовых контактов ‒ между двумя структурами составило 106. EICрасполагается параллельно фосфатным группам ДНК. Для анализа взаимнойориентации молекул нами было выбрано три атома EIC и три атома ДНК,находящиеся ближе всего к выбранным атомам EIC. Атомы первой парыEIС41:H31 ‒ dT37:O1P располагаются на расстоянии друг от друга в 1,68 ǺВ этом случае имеет место образование водородной связи(табл.
7).между водородом карбоксильной группы EIC и кислородом фосфатнойгруппы ДНК. Расстояние между атомами в следующей паре EIС41:С10 ‒dT34:H1' составляет2,88 Ǻ. В ней участвуютатомы углерода EIС,образующие двойную связь в самой EIС, и атом водорода дезоксирибозы приостатке пиримидина. Между предпоследним углеродным атомом в EIС иводородомдезоксирибозыприпиримидине(dT34:H5'1)расстояниесоставляет 2,96 Ǻ (Тарасов и др., 2012).В анионной форме количество межатомных расстояний между атомамиДНК и линолевой кислоты менее 3,4 Ǻ меньше на 30% по сравнению снейтральной формой и составляет 74 (рис.
12, Б). Для описания комплексаанионной формы EIС и ДНК нами были выбраны те же группы атомов, что иприописаниипредыдущегокомплекса.Вотсутствиеводородакарбоксильная группа приобретает отрицательный заряд, что приводит котдалению головки жирной кислоты от отрицательно заряженного кислородафосфатной группы ДНК, поэтому расстояние (dT37:0-1P ‒ EIC41:O2)составляет 3,82 Ǻ (Тарасов и др., 2012).117АБРис. 12. Структура комплексов жирных кислот и олигонуклеотида (dA)25·(dT)25(компьютерный эксперимент с помощью программного пакета NAMD): а) линолеваякислота (нейтральная форма); б) линолевая кислота, анион; ориентация цепи ДНКизменена для обеспечения лучшего угла обзора комплекса (атомы кислорода – красные;углерода – голубые; водорода ‒ белые).118Таблица 7Межатомные нековалентные взаимодействия для оптимизированныхкомплексов линолевая кислота ‒ ДНК и в ходе их динамики (Тарасов и др., 2012)Этап молекулярнойдинамикиРасстояния между участками структурлинолевой кислоты и ДНК, ǺЛинолевая кислота,нейтральная формаEIС41:С18 ‒dT34:H5'1EIС41:С10 ‒dT34:H1'EIС41:H31‒dT37:O1PПосле оптимизации, Ǻ2,962,961,68Конец молекулярнойдинамики, Ǻ3,775,624,89Среднее значение в ходединамики, Ǻ5,6859,2164,87dA10:H1'‒EIC41:C17dT35:H5'‒EIC41:C13dT35:H5'‒EIC41:C133,572,672,83Конец молекулярнойдинамики, Ǻ3,145,76‒Среднее значение в ходединамики, Ǻ4,345,1882,91Анион линолевой кислотыПосле оптимизации, ǺПри этом углероды при двойной связи в анионе взаимодействуют не сводородамидезоксирибозы,Предпоследнийуглеродажирнойсводородами,кислотыфосфатныхрасположенотгрупп.водородадезоксирибозы на расстоянии 3,57 Ǻ.
Таким образом, центр молекулыжирной кислоты располагается ближе к ДНК по сравнению с ее полярнойчастью и гидрофобным «хвостом» (Бойко и др., 2008; Дьячков и др., 2011;Жданов, Кубатиев, 2003; Жданов и др., 2005; Тарасов и др., 2012; Dyachkov etal., 2002; Stoddard, Koshland, 1992).Молекулярная динамикаМолекулярная динамика комплекса нейтральной линолевой кислотыпоказывает большую конформационную подвижность лиганда (рис.
13).119Линолевая кислота удерживается в малой бороздке ДНК за счетуглеводородного хвоста, в то время как ‒ СООН-группа и центральная частьмолекулы (атомы начиная с 9-го углерода) периодически теряют контакт сатомами ДНК (рис. 14). Это хорошо видно по динамике образования иразрыва водородной связи между H31 линолевой кислоты и кислородомодной из фосфатных групп ДНК. Отметим, что молекула линолевой кислотыостается связанной в течение 2 нс динамики.
Для аниона линолевой кислотыоптимизированнаямежатомныхструктуранековалентныхизначальноконтактов,содержитчемменьшееструктурачислонейтральногокомплекса, что связано с отталкиванием отрицательно заряженногокислорода карбоксильной группы EIC и кислорода фосфатной группы ДНК.Однако в ходе молекулярной динамики количество межатомных контактоввозрастает, что, видимо, связано с тем, что система покидает локальныйминимум и переходит в более выгодную конформацию (рис. 15).Аналогичная ситуация наблюдается для траектории молекулярной динамикилинолевой кислоты (Тарасов и др., 2012).Рис.
13. Изменение среднеквадратичного отклонения координат структур (верхняя кривая –линолевая кислота, нижняя кривая ‒ ДНК) в ходе молекулярной динамики со временем.Абсцисса – время, пс, ордината – RMSD, среднеквадратичное отклонение координатструктур, Ǻ.120АБРис. 14. Динамика взаимодействий ДНК и линолевой кислоты (нейтральной). А ‒изменение общего числа межатомных нековалентных контактов между ДНК и линолевойкислотой со временем: абсцисса – время (расстояние между вертикалями равно 500 пс),ордината – число межатомных взаимодействий. Б ‒ изменение расстояния междурепрезентативными атомами ДНК и линолевой кислоты со временем: абсцисса – время,пс, ордината ‒ расстояние между атомами, Ǻ.121Рис.
15. Изменение общего числа межатомных нековалентных контактов между ДНК ианионом линолевой кислоты со временем.Свободная энергия связывания олигонуклеотида и линолевой кислотыИз зависимости свободной энергии связывания А(ξ) линолевой кислотыс ДНК от координаты реакции, получаем, что величина энергии связыванияравна 8 ккал/моль для аниона линолевой кислоты и 13 ккал/моль длянейтральной молекулы. Разница в значениях энергии связывания аниона икислоты, вероятно, является следствием электростатического отталкиваниямежду фосфатными группами сахаро-фосфатного остова ДНК и ‒ СОО-группой жирной кислоты, в то время как в протонированной форме жирнойкислоты водород ‒ СООН-группы способен образовывать водородную связьс кислородом фосфатной группы ДНК.
Это значение совпадает со значениемэнергии связывания линолевой кислоты с декамером ДНК, полученнымметодом молекулярного докинга ‒ 13,3 ккал/моль (Дьячков и др., 2011).Полученное ранее значение энергии связи ДНК и нейтральной формылинолевой кислоты для вакуума (48 ккал/моль) является сильно завышенным(Жданов и др., 2003а,б). Определенное нами значение энергии связываниялинолевой кислоты с ДНК сравнимо и даже превышает энергию связывания122специфических лигандов, антибиотиков и противораковых препаратов(Тарасов и др., 2012; Dolenc et al., 2005).Полученные результаты подтверждают возможность существованиякомплексов между дуплексом ДНК и жирными кислотами, в частности слинолевой кислотой, и находятся в согласии с предыдущими работами(Дьячков и др., 2011).
Комплекс нейтральной линолевой кислоты с ДНКявляется более стабильным, чем комплекс аниона, на 5 ккал/моль. Повидимому, отрицательный заряд остова ДНК не является препятствием ксуществованию таких комплексов. Нейтральная форма линолевой кислотыобразует с фосфатными группами ДНК водородную связь, что может влиятьна стабильность дуплекса (Тарасов и др., 2012).2.3.3.2. Особенности комплексообразования ДНК с олеиновой кислотойпо данным молекулярной динамики и спектров ЯМРРанние работы по изучению взаимодействия ДНК и олеиновой кислотызарегистрировали лишь сам факт комплексообразования (Zhdanov et al.,2002d).
Для изучения структурных особенностей комплексов ДНК ‒олеиновая кислота мы исследовали методом ЯМР высокого разрешениявлияние комплексообразования ДНК с олеиновой кислотой на сигналыпротонов ее водородных связей. С этой целью мы регистрировали спектрыЯМРдекануклеотидаДНК(d(GCGTTAACGC)2,«Синтол»,Россия,молекулярная масса 3028) в слабом поле (12‒14 м.д.) до и после титрованияего олеиновой кислотой с «отжигом» продукта взаимодействия и без«отжига».Нарис.16,Апредставленобзорный1Н-ЯМР-спектрдекануклеотида в воде, из которого следует, что область сильных полей (1‒8м.д.) этого спектра не информативна из-за большого числа протонных пиковДНК. Мы предположили, что более информативной будет слабопольнаяобласть этого спектра в диапазоне 12‒14 м.д., поскольку в ней локализованылишь хорошо разрешенные пики атомов водорода, участвующих в123образовании уотсон-криковских водородных связей А-Т (две связи) и C-G(три связи), экспонированных в большую бороздку (рис.
16, Б). Придобавлении олеиновой кислоты к декануклеотиду величины химическихсдвигов сигналов протонов водородных связей в слабом поле спектра ЯМР сотжигом или без не изменились. Таким образом, связывания олеиновойкислоты с ДНК по большой бороздке нами обнаружено не было (рис. 16, Б).Поскольку водородные связи А-Т- и C-G- пар нуклеотидов ДНКэкспонированы более в большую бороздку ДНК, можно заключить, чтоолеиновая кислота либо не связывается с ДНК, либо связывается с ДНК не побольшой, а по малой бороздке.В комплексе олеиновой кислоты (OLA) c ДНК количество межатомныхвзаимодействий составило 46.Водород карбоксильной группы OLA(OLA41:H4) в ходе оптимизации подходит ближе к ДНК и образуетводородную связь с азотом пуринового основания (dA10:N3).
Длинаводородной связи dA10:N3 ‒ OLA41:H4 составляет 1,82 Å (табл. 8, рис. 17, 18).Таким образом, водородная связь образуется уже не с атомом кислородафосфатной группы, а непосредственно с азотистым основанием, что можетпотенциально оказывать влияние на стабильность дуплекса. Это, вероятно,обусловлено различиями в пространственной конфигурации олеиновой илинолевой кислот. Кроме того, следует отметить, что взаимодействие сазотистыми основаниями может иметь сиквенс-специфичный характер(Дьячков и др., 2011; Тарасов и др., 2012).Как и с другими жирными кислотами, основную роль в стабилизациикомплекса играют ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия (рис.
18).С-С двойной связи (OLA41:C10) располагается близко (2,99 Å) к водородудезоксирибозы (dT35:H1'). Дальше всех по отношению к атомам ДНКрасполагаются хвостовые атомы OLA. Так, расстояние между OLA41:C17 иближайшим к ней атомом в ДНК (dA7:H4' ‒ водород дезоксирибозы) составляет3,37 Å.124АРис. 16. Спектры ЯМР комплекса декамераДНК с олеиновой кислотой: A – спектр ЯМР всильном и слабом полях; Б ‒ спектры ЯМР вслабом поле (представлен диапазон спектра от11,5 до 14,5 м.д.): а) ДНК; б) ДНК+олеиноваякислота до «отжига» (1:1 по массе);в) ДНК+олеиновая кислота после «отжига»(1:1 по массе); г) ДНК+олеиновая кислотапосле «отжига» и добавления этанола (1:1 помассе).Б125Таблица 8Значения репрезентативных расстояний межатомных нековалентныхконтактов для оптимизированного комплекса ДНК и олеиновой кислоты и впроцессе молекулярной динамикиПары атомов ДНК ‒dA10:N3‒dT35:H1'‒dA7:H4'‒олеиновая кислотаOLA41:H4OLA41:C10OLA41:C171,822,993,373,775,624,893,5375,4085,367Расстояние послеоптимизации, ǺРасстояние на конецмолекулярной динамики, ǺСреднее значение в ходединамики, ǺРис.
17. Динамика контактов ДНК и олеиновой кислоты. Изменение общего числамежатомных нековалентных контактов между ДНК и олеиновой кислотой со временем.126АБРис. 18. А ‒ структура комплекса олеиновойкислоты (нейтральная форма) и олигонуклеотидаA-T. Ориентация цепи ДНК изменена дляобеспечения лучшего угла обзора комплекса.Б ‒ водородная связь между водородомкарбоксильной группы олеиновой кислоты иазотом аденина.При взаимодействии линолевой и олеиновой кислот с ДНК на долюводородных связей приходится около 1/5 части из всех возможных(водородных, гидрофобных, ван-дер-ваальсовых и электростатических)связей.1272.3.3.3. Молекулярная динамика комплексов ДНК с фосфолипидомРанние работы по изучению взаимодействия ДНК и олеиновой кислотыподтвердили лишь факт комплексообразования (Жданов и др., 2003а,б).Связывание олеиновой кислоты по малой бороздке ДНК было показано какметодами спектроскопии (Zhdanov et al., 2002d), так и с помощьюкомпьютерного моделирования (Жданов и др., 2003а).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
