Диссертация (1151325), страница 15
Текст из файла (страница 15)
В качестве важногозащитного фермента, способного катализировать нерадикальное разложениепероксида водорода на кислород и воду, выступает каталаза. Каталазаявляетсяоднимизферментовантиоксидантнойзащитыорганизма(Jnaneshwari et al., 2013; Parihar et al., 2014; Rasool et al., 2014).Активность фермента определяется по количеству разложившейся подвлияниемкаталазыкровипероксидаводорода.Методоснованнаспособности пероксида водорода образовывать с солями молибдата аммонияили натрия стойкое соединение желтого цвета (Валеева и др., 2008в).83К 2 мл 0,03%-ного раствора пероксида водорода добавляют 0,1 млгемолизата крови.
В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 млдистиллированной воды. Через 10 мин добавляют 1 мл 4%-ного растворамолибдата аммония. В качестве контроля ‒ 2 мл дистиллированной воды и1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония (Валеева и др., 2008в).Оптическую плотность пробы определяют на спектрофотометре придлине волны 410 нм против контроля на реактивы. Активность каталазырассчитывают в мккатал/л. Катал ‒ единица ферментативной активности посистеме СИ. Катал соответствует количеству фермента, способногопревращать 1 моль субстрата за 1 с (Валеева и др., 2008в).Активность каталазы в крови рассчитывают по формуле:Е = (Ахол ‒ Аоп) · V · t · k,где Е – активность каталазы, мккат/л; Ахол и Аоп ‒ экстинкция холостой иопытной проб; V ‒ объем вносимой сыворотки, мл; t ‒ время инкубации, с;k ‒ коэффициент миллимолярной экстинкции пероксида водорода, равный22,2 · 10-3 мМ-1 · см-1.
Нормальные величины ‒ показатели интактныхживотных (или здоровых людей) (Валеева и др., 2008в).2.2.6.3. Пероксидазная активность в эритроцитах кровиПероксидаза является гемовым ферментом, катализирующим реакции,в которых участвует пероксид водорода. Пероксидаза выполняет защитныефункции, препятствуя накоплению пероксида водорода, оказывающегоповреждающее действие на клеточные компоненты (Jnaneshwari et al., 2013).Вреакции,катализируемойпероксидазой,пероксидводородавосстанавливается за счет соединений, выступающих в качестве доноровэлектронов, таких как аскорбат, хиноны или цитохром с.Пероксидазы в общем случае катализируют следующую реакцию:Н2О2 + АН2 → 2Н2О + А.84Пероксидазы присутствуют во всех животных клетках, однакоактивность их на несколько порядков ниже активности каталазы.Опишем далее метод основанный на фотометрической регистрациипонижения концентрации индигокармина, который окисляется пероксидомводорода в присутствии пероксидазы крови (Валеева и др., 2008в).На первом этапе готовят гемолизат крови: берут 10 мкл крови и разводятее в 1000 раз (20 мкл крови в 20 мл дистиллированной воды).
Оставляют прикомнатной температуре (гемолизат активен в течение 6 ч). Далее встеклянную пробирку наливают 1 мл ацетатного буфера, 1 мл 0,0005 Мраствора индигокармина и 0,5 мл гемолизата крови, разведенного в 1000 рази хорошо размешивают.
На 5 мин помещают в водяную баню при 30 оС,затем добавляют 0,5 мл 0,03%-ный раствор пероксида водорода, энергичновзбалтывают и одновременно включают секундомер. Ровно через 2 минреакцию останавливают добавлением 3 мл 20%-ной серной кислоты.Контрольные пробы содержат 1 мл ацетатного буфера, 1 мл раствораиндигокармина, 0,5 мл дистиллированной воды вместо раствора пероксидаводорода, 3 мл 20%-ной серной кислоты.
В контрольных пробах порядокдобавления реактивов не имеет значения (Валеева и др., 2008в).Контрольные и опытные пробы колориметрируют в кювете длиной1 см на СФ при 610 нм (или фотометрируют на ФЭКе при использованиикрасного светофильтра) против дистиллированной воды не позднее, чемчерез 1 ч, так как при более длительном выжидании окраска бледнеет.Пероксидазнуюактивность(Апер)кровивычисляютвинтернациональных единицах по формуле Веберта и Рихтериха (Валееваи др., 2008в):ΔЕ · 106 · ЕVАпер = ---------------------------- ,ΔЕ · d · Т · AV85где ΔЕ ‒ разность экстинкции между контрольной и опытной пробами; 10 ‒молярный коэффициент экстинкции индигокармина; d ‒ толщина кюветы,см; Т ‒ время реакции, мин; EV ‒ конечный объем, мл; AV ‒ исходныйобъем, мл.Подставив значения указанных параметров в формулу, получаем, чтоАпер = 571,428·ΔЕ в тысячах долях интернациональной единицы.
Когдаразница в показателях экстинкции контрольных и опытных проб выше 0,60(Е > 0,60), определение повторяют после дополнительного разведения крови1:1, полученный результат умножают на 2. Нормальные величины ‒показатели интактных или контрольных животных. В норме пероксидазнаяактивность крови человека составляет 257,5‒305,67; крыс ‒ 247,7‒259,7;кроликов ‒ 264,8‒283,6 (Валеева и др., 2008в).2.2.6.4. Церулоплазмин в сыворотке кровиЦерулоплазмин представляет собой белок, содержащий 8 ионов Cu+ и 8ионов Cu2+. Это главный медьсодержащий белок крови, и на его долюприходится 3% общего содержания меди в организме.
Церулоплазминобладает ферментативными свойствами. Он катализирует восстановлениемолекулярного кислорода до Н2О. Он также может катализировать окислениеFe2+доFe3+.антиоксидантныесодержаниямедиСовокупностьсвойства.вэтиххарактеристикЦерулоплазминорганизме:приопределяетучаствуетболезнивегорегуляцииВильсона‒Коноваловапроисходит накопление меди в организме и уровень церулоплазмина падает.Снижение церулоплазмина также отмечается при нефротическом синдроме уновороженных. Повышение концентрации церулоплазмина в сывороткекрови характерно для лихорадочных состояний, заболеваний центральнойнервной системы, печени (гепатитов, циррозов, механической желтухи),ревматических заболеваний, опухолевых процессов, туберкулеза, сифилиса,беременности. Это может отражать компенсаторное увеличение содержания86церулоплазмина при активации перекисных процессов (Валеева и др., 2008в;Musci et al., 2014; Ogra, 2014).Приниципметодаоснованнаокислениир-фенилендиаминацерулоплазмином.
По оптической плотности образующихся продуктовопределяется содержание церулоплазмина в сыворотке крови.веныпоследелонгацииживотныхзабираютвКровьчистуюизпробирку,центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин (Валеева и др., 2008в).К 0,1 мл сыворотки крови добавляют 1 мл 0,4 М ацетатного буфера и0,5 мл 1%-ного раствора парафенилендиамина, перемешивают и ставят втермостат (водяную баню) (60 оС) на 10 мин. Затем приливают 3,5 млохлажденного 25%-ного раствора едкого натрия, тщательно перемешивают.Интенсивность окраски полученной жидкости оранжевого цветаизмеряют на СФ при 440 нм против контроля на реактивы (Валеева и др., 2008в).Полученную на спектрофотометре экстинкцию умножают на 87,5(коэффициент перерасчета). Содержание церулоплазмина выражается вмг%.
Нормальные величины ‒ показатели интактных или контрольныхживотных. У взрослых людей нормальные величины – 25‒45 мг% (Валееваи др., 2008в).872.2.7. СОДЕРЖАНИЕ МАКРО- И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В ОРГАНАХ КРЫСЭксперименты проведены на 48 белых рандобредных лабораторныхкрысах обоих полов SPF-категории, в каждой группе по 4 самки и 4 самцамассой 230‒250 г. Животныесодержались в условиях вивария согласномеждународным критериям на подстилку rinofix, корм и воду ad libitum.Первая группа ‒ интактные.
Крысам контрольной (второй) группы вводиливнутрибрюшинно, однократно стерильную воду для инъекций (ОАО«Новосибхимфарм», г. Новосибирск). Животным опытных групп в том жережиме вводили циклофосфамид (ЦФ, АО «Биохимик» г. Саранск) в дозе40 мг/кг. Животных эвтаназировали путем делонгации. В гомогенатахголовного мозга, печени и почек определяли содержание биоэлементов.Содержание макро- и микроэлементов определяли методом атомноэмиссионной спектроскопии на спектрометре Optima 2000 DV (PerkinElmer,США) в Центре биотической медицины, г.
Москва. В головном мозге, почкахи печени белых рандобредных лабораторных крыс после внутрибрюшинногооднократного введения ЦФ (40 мг/кг) определяли содержание (мкг/г) 30биоэлементов ‒ 5 макроэлементов: кальций, фосфор, калий, натрий, магний;9 жизненно необходимых элементов: железо, цинк, медь, марганец,молибден, хром, кобальт, селен, йод; 6 условно жизненно необходимыхэлементов: бор, кремний, никель, ванадий, мышьяк, литий ‒ и 10 токсичныхэлементов: олово, серебро, стронций, алюминий, свинец, кадмий, ртуть,бериллий, сурьма, лантан (Ибрагимова и др., 2012б; 2013).Оценку уровня биоэлементов, системы антиоксидантной защитыорганизма и индикаторов ПОЛ проводили с использованием медианы.Нижний и верхний пороговые уровни определяли как 2,5-й и 97,5-йперсентили соответственно.
В работе использовали уровень значимостиp < 0,05 (Хафизьянова и др., 2006).882.2.8. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МОДУЛЯТОРОВ ЛИПИДНОГО ОБМЕНАВ данной главе представлены материалы и методы, использованные вэксперименте по влиянию модуляторов липидного обмена на мутагенез иантимутагенез в клетках мышей. Использовали метод ‒ микроядерныйанализ в эритроцитах периферической крови мышей.
В § 2.2.8.1представлены результаты по мутагенному и антимутагенному эффектамбиологическипозволяетактивныхдатьсоединений.точнуюИспользованиехарактеристикуданногогенетическихметодаэффектовисследованных лекарственных препаратов.2.2.8.1. Оценка мугагенных и антимутагенных эффектов лекарственныхпрепаратов в эритроцитах периферической крови мышей путемрегистрации микроядерИсследования выполнены на белых лабораторных рандобредныхсамцах мышей массой 20 г (1,5‒2-месячный возраст).
На каждый опытный иконтрольный вариант брали по 6 самцов. Животные содержались в условияхвивария согласно международным критериям на подстилку rinofix, корм иводу ad libitum. При определении мутагенного и антимутагенного эффекталиганды адренорецепторов вводили подкожно однократно. Через 8 чвнутрибрюшинновводилииндуктормутаций‒алкилирующийцитостатический препарат ‒ циклофосфамид (ЦФ) в дозе 30 мг/кг.
Мутаген иБАВ растворяли в физиологическом растворе непосредственно передвведением животным. За 2,5 ч до окончания опыта мышам внутрибрюшинновводили 2,5 мг/кг колхицина. Через 24 ч после инъекции производили заборкрови из хвостовой вены мыши, изготавливали мазок и проводилиисследование под микроскопом. Подсчитывали количество клеток смикроядрами из 2000 проанализированных клеток (Ильинских и др. 1991).89В эксперименте использовали следующие лекарственные препараты: эпинефрина гидротартрат (ЭГТ) ‒ стимулятор - и -адренорецепторов(АР), использовали лекарственую форму препарата в ампулах (0,18%)(Харьковское производственное химико-фармацевтическое объединение«Здоровье», г.
Харьков, Украина); фенилэфрин (ФЭР) ‒ стимулятор -АР, использовали лекарственнуюформу препарата в ампулах (1%) (Госкоммедбиопром, Опытный заводГНЦЛС, г. Харьков, Украина); орципреналин (ОРП) – стимулятор -АР, использовали лекарственнуюформу препарата в ампулах (0,05%) (Познаньский фармацевтический завод«Польфа», г. Познань, Польша); пророксан (ПРС) ‒ блокатор -АР, использовали лекарственную формупрепарата в таблетках по 0,015 г или в ампулах (1%) (АО «Ай си эноктябрь», г. Санкт-Петербург); пропранолол (ППЛ) ‒ блокатор -АР, использовали лекарственную формупрепарата в таблетках по 40 мг или в ампулах (0,1%) (ISIS PHARMA,г. Цвиккау, Германия) (Ибрагимова и др., 2011б; 2014а; Lee et al., 2013;Tayel et al., 2012; Ward et al., 2014).При исследовании индикаторов ПОЛ, системы антиоксидантнойзащитыорганизма,генетическихэффектовлекарственныхсредств,определении уровня биоэлементов в качестве мутагена использовалициклофосфамид (ЦФ, АО «Биохимик» г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
