Диссертация (1151325), страница 19
Текст из файла (страница 19)
масса аниона дляС18Н31О2 279,4428) кислоты (отрицательная ионизация) (табл. 6, пики 1–3).В предыдущих работах (Жданов и др., 2006а,б; Стражевская и др., 2009;Zhdanov et al., 2006) по изучению ЖК-профиля ДНК-связанных липидовP. aurantiaca мы также обнаружили в клетках экспоненциальной фазы росталинолевую кислоту 18:2, хотя и в следовых количествах. Этот факт необыченпо двум причинам: во-первых, полиненасыщенные кислоты не свойственныпрокариотамиобнаруживалисьлишьвлипидахорганизмовприэкстремальных условиях (Ruiz et al., 2006; Zhdanov et al., 2006). Во-вторых, внастоящем исследовании линолевая кислота 18:2 и другие приведенныевыше жирные кислоты обнаружены не в составе фосфолипидов, то есть ввиде соответствующих метиловых эфиров, как это делается при анализежирнокислотного состава методом газовой хроматографии (Zhdanov et al.,2006).
При ESI-LC-MS анализе жирные кислоты, в том числе С18:2,обнаружены в составе анализируемых фракций без омыления в эфиры, тоестькаксвободныекислоты.Следуетотметить,чтотранс,транс-конформация линолевой кислоты 18:2 облегчает ее связывание с малойбороздкой ДНК, имеющей форму скрученного бумеранга (Дьячков и др.,2011). Это обстоятельство может объяснить присутствие во фракциях ДНКсвязанных липидов свободных ненасыщенных жирных кислот. Припозитивном режиме регистрации масс-спектров обеих фракций, как иследовало ожидать, не было зарегистрировано пиков, соответствующихжирным кислотам. Интересно, что стеариновой кислоты 18:0, базовой дляпула общих клеточных липидов (Стражевская и др., 2009), не обнаруженосреди свободных жирных кислот обеих фракций ДНК-связанных липидов.В масс-спектрах ESI-MS ДНК-связанных липидов нами также не были111обнаружены пики, соответствующие карбоксилат-ионам 3-гидрокси жирныхкислот: 3-ОН 10:0 и 3-ОН 12:0. Это свидетельствует о том, что в этихлипидных фракциях отсутствуют 3-гидрокси жирные кислоты, маркерныедля общих клеточных липидов представителей таксона Pseudomonas.Следовательно ДНК-связанные липиды являются отдельной фракциейлипидов, отличной по составу от общих липидов клеток P.
aurantiaca(Стражевская и др., 2009). Не были также обнаружены короткие жирныекислоты (от С4 до С10), однако это неудивительно, поскольку такие кислотыможно зарегистрировать лишь с использованием специальных методик(Жданов и др., 2014б; 2015; Zhdanov et al., 2006).Таблица 6Липиды, обнаруженные во фракции 2 ДНК-связанных липидовPseudomonas aurantiaca*№пиковm/z пика1234(14а,б,в)227,1253,3279,3621,4/623,4/625,65678910745,6762,2795,2834,4805,51468,4Времявыхода,мин5,4–6,4–«––«–22–24Электр.режим,условияОтр.Отр.Отр.Отр.ИдентификацияАнион 14:0Анион 16:1Анион 18:2ЛизоФИ (18:0)29–3039,9–41,5–«––«––«–>50Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Пол.ФГ (16:0, 18:2)ФС (16:0, 18:0)ФС или ФГTAГ (16,16,18)TAГ (16:0)КЛ (4 по 18:1)или димер ФХТеоретическая массаиона, Да227,3678253,4068279,4428598,6687(–2Н)600,6867602,7047(+2Н)747,0018762,0165775,0552835,3831807,32971466,0585или2×734,0485Примечания–––+23 (Na)Триплетпиков–2Н–+ Na+–+ 2 Н++ 2Н+*Отр. – режим отрицательной ионизации; Пол.
– режим положительной ионизации;КЛ – кардиолипин; ТАГ – триацилглицерид; ФГ – фосфатидилглицерин; ФС –фосфатидилсерин; Лизо-ФИ – лизофосфатидилинозит.112Рис. 11. Профиль элюции высокоэффективной хроматографии (А) и масс-спектр (Б)фракции ДНК-связанных липидов Pseudomonas aurantiaca (фракция 2). А – профильэлюции фракции 2 от 20 до 72 мин (скорость 200 мкл/мин, ацетонитрил : вода (9:1), рН 7,инъекция 5 мкл, Sauele RP, колонка С18), серая полоса – элюаты на масс-спектр; Б – массспектр фракции 2 (элюаты со временем выхода 22,279–23,760 мин), абсцисса – отношениемассы иона к его заряду, amu, единица массы, ордината – интенсивность пика, условныеединицы; режим отрицательной ионизации.
Отмечен триплет молекулярных ионов лизофосфатидилинозитола (лизо-ФИ) с m/z 621,4; 623,4 и 625,6.Таким образом, жирнокислотные профили фракций ДНК-связанныхлипидов P. aurantiaca, определенные методом газовой хроматографии(Жданов и др., 2006а,б; 2014б; Zhdanov et al., 2001; 2006) (базовые жирныекислоты сложных липидов 14:0, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 во фракциях 1 и 2) иметодом масс-спектрометрии LC-ESI-MS (базовые свободные жирные113кислоты, не входящие в состав сложных липидов: 16:0 и 18:1 во фракции 1 икислоты 14:0, 16:1 и 18:2 во фракции 2) различаются и дополняют друг друга,что поможет глубже изучить роль ДНК-связанных жирных кислот и липидовв функционировании хроматина (Жданов и др., 2014б; 2015).Фосфолипиды.
После хроматографического разделения фракций 1 и 2 ДНКсвязанных липидов P. aurantiaca были получены масс-спектры основныхкомпонентов с определенным временем выхода с колонки. Табл. 5 и 6содержат значения параметров веществ в основных пиках масс-спектровфракций 1иотрицательной2 ДНК-связанных липидов, полученныхиположительнойионизации,в режимахкоторыеудалосьидентифицировать. В масс-спектрах фракции 1 пики с m/z 621,4 и 623,2 свременем выхода 29–30 мин соотносятся с лизо-фосфатидилинозитолом(лизо-ФИ) (табл. 5, пики 3 а,б), причем к теоретически рассчитанным массамионов добавляется масса иона натрия. Пик спектров фракции 1 (режимотрицательной ионизации) с m/z 745,6 (табл. 5, пик 4) может принадлежатьаниону фосфатидилглицерина (ФГ 16:0/18:2).
Следующие пики ионовполучены в режиме положительной ионизации. Пик 5 с m/z 798,6 (табл. 5)соотнесен с ФГ (18:1/18:1) и ионом натрия (теор. масса 775,0552 Да плюсмасса иона Na+ 23 Да), пик с m/z 747,8 (табл. 5, пик 6) также соотносится сФГ (16:1/18:1), пик с m/z 736,6 – с фосфатидилсерином (ФС 16:0/16:0) (табл. 5,пик 7), а пик c m/z 760,8 – с фосфатидилхолином (ФХ 16:0/18:1) (табл. 5, пик 8).Вмасс-спектрахимеетсяпиксm/z891,1,соответствующийфосфатидилинозитолу (ФИ 18:0/18:0) (теор. масса 867,1513 Да с ионом Na+23 Да) (табл. 5, пик 9) (Жданов и др., 2014б; 2015).В табл. 6 приведены также масс-спектры элюатов фракции 2. Пики 4а,б,в (621,3/623,3/625,6 время выхода 22,3-23,8 мин) могут быть соотнесены спроизводным лизоФИ с ионом натрия (623,6867 Да).
Пик № 6 с m/z 762,2cоотносится с ФС (16:0/18:0), пику 8 с m/z 834,4 соответствует масса835,3831 триацилглицерида (ТАГ, 16:0/16:0/18:0). Пик 9 с m/z 805,5 может114быть также обусловлен ТАГ (16:0). В масс-спектре фракции 2 имеется такжепик при больших временах выхода (50 мин и более) m/z 1468 (табл. 6, пик 10),который может быть обусловлен наличием кардиолипина или димерафосфатидилхолина (Жданов и др., 2014б; 2015).Ранее опубликованные данные о составе и содержании липидов вофракциях ДНК-связанных липидов бактерий и эукариотических клеток былиполучены методом тонкослойной хроматографии (Стручков, Стражевская,1993; Шепелев и др., 1995; Zhdanov et al., 2001).
В настоящее время дляисследований липидов и липидного обмена применяют электроспрей идругие современные методы масс-спектрометрии (Fuchs et al., 2010).Методом тонкослойной хроматографии в работах сотрудников нашейлаборатории было показано, что липидные фракции прочносвязанных с ДНКлипидовэукариотсодержат:КЛ40-50%(отобщегоколичествафосфолипидов), ФЭ 25–30%, ФХ 15–20%, ФС 5–7%, ФИ 3% (Жданов,Кубатиев, 2003; Стручков, Стражевская, 1993).
Фракции прочносвязанныхлипидов (фракция 2) прокариот (E.сoli В) и фага T2 включали КЛ 60–70 % иФЭ 30–40% (Стручков, Стражевская, 1993; Шепелев и др., 1995). Из этихданных следует, что ДНК-связанные липиды имеют специфический состав,отличающийся от состава клеточных липидов у прокариот и от липидногосостава ядерной мембраны и ядерного матрикса. При исследовании ДНКсвязанных липидов эухроматина (эДНК), гетерохроматина (гДНК) иядерного матрикса (ямДНК) тимуса и печени крысы впервые было показано,что эДНК содержит различные по составу слабо- и прочносвязанные липиды(фракции 1 и 2, соответственно), тогда как гДНК и ямДНК содержат толькофракцию 2 таких липидов. Для всех фракций липидов было характернопреобладание фосфолипидов над нейтральными липидами (Стражевская идр., 2004).
Фракции эДНК и ямДНК активны в репликации и транскрипции иобогащеныкислымифосфатидилинозитом,аФЛ:кардиолипином,такжесвободнымифосфатидилсерином,жирнымикислотамии115диглицеридами, в отличие от липидов гДНК (Стражевская и др., 2004).Предполагается важная роль кардиолипина в репликации, а свободныхжирных кислот в транскрипции ДНК. В работах (Manzoli et al., 1982; Maraldiet al., 1982) было установлено, что кислые фосфолипиды (КЛ, ФС), какправило, способствуют деконденсации хроматина, а нейтральные, наоборот,его конденсируют, причем деконденсация сопровождается не толькодисперсией фибрилл хроматина, но и переходом от соленоидной кнуклеосомной структуре и потерей гистона Н1 (Maraldi et al., 1982).В настоящем исследовании впервые реализован, как пилотный проект,подход к исследованию липидома «хроматина» прокариотической клетки,основанный на изучении липидного профиля ДНК-связанных липидовметодом масс-спектрометрии с использованием электроспрей ионизации(ESI-LC-MS).
Этим методом мы, во-первых, подтвердили полученные ранееданные о липидном профиле ДНК-связанных липидов, и во-вторых,обнаружили, что для обеих фракций ДНК-связанных липидов характерноналичиефосфатидилглицерина,фосфатидилсеринаилизо-фосфатидилинозитола. В спирторастворимой фракции 1 ДНК-связанныхлипидов могут содержаться также фосфатидилхолин и фосфатидилинозитол,а во фракции 2 прочносвязанных липидов – триацилглицериды икардиолипин. Необходимо отметить, что использование методов ESI-LC-MSи ESI-LC-MS/MS, который мы планируем использовать в развитии этойработы, расширяет возможности изучения липидома нуклеоида прокариот посравнению с хроматографией, позволяющей определить ЖК-состав липидов,ипоможетопределитькаксвободныежирныекислоты,таки(фосфо)липиды ДНК-связанных липидов, а это, в свою очередь, позволитполнее исследовать их функцию в бактериальной клетке в зависимости от ееприроды, физиологического возраста и факторов внешней среды (Жданов идр., 2014б; 2015).1162.3.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
