Диссертация (1151325), страница 18
Текст из файла (страница 18)
ЖИРНОКИСЛОТНЫЕ И ЛИПИДНЫЕ ПРОФИЛИ ФРАКЦИЙ ДНК-СВЯЗАННЫХЛИПИДОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS AURANTIACAДалее мы исследовали ЖК-маркеры фракций ДНК-связанных липидовгеномной ДНК прокариот при различных способах ее выделения. Насинтересовали ЖК-маркеры супрамолекулярного комплекса ДНК, связанные сДНК, или РНК, или белками, или с их комплексами.В работе былаиспользована лишь фракция прочносвязанных липидов, на которую внезависимыхэкспериментахдействовалипоочередноферментами,гидролизующими ту или иную компоненту супрамолекулярного комплексаДНК: или ДНКазой I, или РНКазой A, или протеиназой K (Жданов и др., 2014а).Затем определяли ЖК- и липидный составы слабо- и прочносвязанной фракцийДНК связанных липидов Pseudomonas aurantiaca (Жданов и др., 2014а,б; 2015).2.3.2.1.
Жирнокислотные профили фракций ДНК-связанных липидовPseudomonas aurantiaca, выделенных детергентным методомИзвестно, что основными компонентами надмолекулярного комплексаДНК (нкДНК) являются ДНК (79‒88%), РНК (10–15%), белки (1–3%) илипиды (1–3%) (Struchkov et al., 2002a,b). Для идентификации и анализалипидов по МЭЖК-профилю мы независимо обрабатывали нкДНК илиДНКазой I, или РНКазой А, или протеиназой К и исследовали профильметиловых эфиров жирных кислот полученной фракции. Нами обнаружено,что основными компонентами ЖК профиля ДНК-связанных липидовпрепарата геномной ДНК, выделенного детергентным методом, являютсякислоты ‒ 16:0 и 18:0, а 10:0, 11:0 2OH, 13:1 и 13:0 2OH кислоты содержатсяв меньшем количестве (рис.
7) (Жданов и др., 2012; 2014а,б; 2015).Из данных, представленных на рис. 7, А‒Г, можно определитьмаркерныеМЭЖКдлякаждойгруппылипидов,связанныхсбиомакромолекулами ‒ гидроксикислоты 11:02ОН и 13:02ОН входят в составлипидов, связанных с белками; 14:1ω5с – связаных с белками и РНК, а15:1ω8с – связанных с ДНК (Жданов и др., 2014а).104АБВГРис. 7. Идентификация и анализ липидов, прочносвязанных с ДНК, выделенныхдетергентным методом:А) содержание жирных кислот в необработанном ферментами образце комплексовДНК с белками, РНК и липидами.
По оси ординат (во всех рисунках) – содержание жирнойкислоты (в %), по оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0, 2 – 11:0 2ОН,3 – 13:1, 4 – 13:0 2ОН, 5 – 16:0, 6 –18:0;Б) содержание жирных кислот в обработанном ДНКазой I образце комплексов ДНК сбелками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 11:0 2ОН, 3 – 14:0, 4 – 14:1ω5с, 5 – 16:0, 6 – 18:0;В) содержание жирных кислот в обработанном РНКазой А образце комплексов ДНК сбелками, РНК и липидами.
По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 13:0 2ОН, 3 – 14:0, 4 –15:1ω8с, 5 – 16:0, 6 – 18:0;Г) содержание жирных кислот в обработанном протеиназой К образце комплексовДНК с белками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку:1 – 10:0, 2 – 14:0, 3 –15:1ω8с, 4 – 16:0, 5 – 18:0, 6 – 18:3ω6с.105Этот способ позволяет установить ЖК-состав липидов, прочносвязанных сДНК,которыеостаютсяпослеобработкинкДНКразличнымигидролизующими ферментами. Полученные результаты впоследствии могутбыть использованы при разработке новых методов диагностики заболеваний полипидному составу ДНК-связанных липидов пациента или новых типовлекарственных средств (Жданов и др., 2014а).2.3.2.2.
Жирнокислотные профили фракций ДНК-связанных липидовPseudomonas aurantiaca, выделенных фенольным методомВслучаеМЭЖК-профиляДНК-связанныхлипидовнкДНК,выделенного фенольным методом, максимальным содержанием обладаютнасыщенные кислоты (рис. 8, А): 12:0 (№ 4) (30%), 16:0 и 18:0 (по 15%), аминорными являются линоленовая кислота (№ 10) (2%), 12:1, 13:0 2ОН, 15:1ω8C (по 3‒4%).
После обработки ДНКазой I максимум содержанияприходится на кислоты 16:0, 18:0 (по 26–27%) и 10:0 (12%) (рис. 8, Б).Кислоты 16:0 и 18:0, так же как и в случае выделения детергентным методом,входят в состав всех групп липидов. Минорная кислота 15:1 ω8c входит всостав всех трех групп липидов, линоленовая кислота 18:3ω6с – в составлипидов, связанных с белками (рис. 8, Г), а 11:0 iso3OH – в состав липидов,связанных с РНК и белками (рис.
8, В,Г). Таким образом, способ выделениянкДНК влияет на ЖК-состав всех трех групп липидов (связанных с ДНК,РНК или белками), что может быть частично обусловлено переносоммембранных липидов к ДНК фенолом (Жданов и др., 2014а,б; 2015).106АВБГРис. 8. Идентификация и анализ липидов, прочносвязанных с ДНК, выделенных фенольнымметодом:А) содержание жирных кислот в необработанном ферментами образце комплексовДНК с белками, РНК и липидами.
По оси ординат (во всех рисунках) – содержание жирнойкислоты (в %), по оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0, 2 – 11:0 iso3ОН, 3 – 11:0 2ОН, 4 – 12:0, 5 – 12:1 , 6 – 13:0 2ОН, 7- 15:1 ω8с, 8 – 16:0, 9 – 18:0,10 – 18:3 ω6с (6,9,12);Б) содержание жирных кислот в обработанном ДНКазой I образце комплексов ДНК сбелками, РНК и липидами.
По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 11:0 2ОН, 3 – 13:0 2ОН, 4 – 14:0, 5 – 14:1 ω5с, 6 – 15:1 ω8с, 7 – 16:0, 8 – 18:0;В) содержание жирных кислот в обработанном РНКазой А образце комплексов ДНК сбелками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 11:0 iso 3OH, 3 – 11:0 2OH, 4 – 13:0 2OH, 5 – 14:0, 6 – 15:1 ω8c, 7 – 16:0, 8 – 16:0 3OH,9 – 18:0;Г) содержание жирных кислот в обработанном протеиназой К образце комплексовДНК с белками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку:1 – 10:0, 2 – 11:0 iso 3OH, 3 –11:0 2OH, 4 – 12:1, 5 – 13:0 2OH, 6 – 14:0, 7 – 15:1 ω8c, 8 – 16:0,9 – 18:0, 10 – 18:3 ω6c (6,9,12).1072.3.2.3.
Жирнокислотный и фосфолипидный профили фракций липидов,прочносвязанных с ДНК грамотрицательной бактерииPseudomonas aurantiacaДалее определяли ЖК- и липидный состав слабо- и прочносвязаннойфракций ДНК связанных липидов Pseudomonas aurantiaca.Ранее в работах (Стражевская и др., 2004; Zhdanov et al., 2006) былопоказано существование базовых ЖК-остатков в гидролизатах фракций ДНКсвязанных липидов. Для анализа фракций 1 и 2 ДНК-связанных липидов вданнойработемыиспользоваливысокоэффективнуюжидкостнуюхроматографию ВЭЖХ (LC) в сочетании с методом масс-спектрометрии сиспользованием электроспрэй-ионизации (ESI-MS) (метод ESI-LC-MS) (Abbet al., 2009).
Это исследование было предпринято как пилотный проект сцелью получения данных для последующего использования метода ESI-LCMS/MS и двухкамерных масс-спектрометров для анализа ДНК-связанныхлипидов. Методом ВЭЖХ (LC) c элюцией смесью ацетонитрил : вода (9:1)липиды разделяются на колонке RPС18 по их полярности, а массспектрометрический метод (ESI-MS) позволяет измерять масс-спектрыкомпонентов фракций в различных режимах ионизации (отрицательная илиположительная ионизация, negative or positive mode) (рис.
9‒11) (Жданов идр., 2015).Жирные кислоты. Табл. 5 и 6 содержат значения величин m/z изначениямолекулярныхионовбазовыхжирныхкислот,атакже(фосфо)липидов фракций 1 и 2 ДНК-связанных липидов P. aurantiaca.В масс-спектрометрах фракции после разделения суммарной фракции 1ДНК-связанных липидов методом ВЭЖХ (время выхода 8,38–8,83 мин) (ESILC-MS, negative mode, pH 7.0, ацетонитрил : вода, 9:1) нами обнаруженытолько пики, соответствующие карбоксилат–анионам свободных жирныхкислот (табл. 5, рис.
9). Этими кислотами (в диапазоне от С10 до С20)оказались пальмитиновая (С16:0) (m/z 255,4; теор. масса аниона для С16Н31О2255,4228) и олеиновая (С18:1) (m/z 281,4; теор. масса аниона для С18Н33О2108281,4601) кислоты, являющиеся базовыми не только для общих, но и дляДНК-связанных липидов P.
aurantiaca. Причем в пике со временем выхода8,380 мин элюировалась лишь пальмитиновая кислота, в пиках со временемвыхода 8,606–8,832 мин – обе кислоты, С16:0 и С18:1 (Жданов и др., 2014б;2015).Таблица 5Липиды, обнаруженные во фракции 1 спирторастворимых ДНК-связанныхлипидов Pseudomonas aurantiaca*№пиков1m/z пика255,3ВремяЭлектр.Идентифи-Теоретичес-Примеча-выхода,режимкациякая массанияминУсловия8,380Отр.,иона, ДаАнион 16:0255,4228Один пикОтр.,Анионы255,4228Два пикарН 716:0 / 18:1281,4608Отр.,Анионы255,4228рН 716:0 / 18:1281,4608рН 72а,б255,4/8,606281,52а,б255,3/8,832281,5621,4/3а,б623,229–30Пол.Лизо-ФИДва пика598,6687+23 (Na)(–2Н)Дублет600,6867ионов4745,630Отр.ФГ (16:0/18:2)747,0018–2 Н+5798,6/36,47Пол.ФГ (18:1/18:1)/775,0552/+23 (Na)ФГ (18:0/18:0)803,0910803,86747,837,7–39Пол.ФГ (16:1, 18:1)747,001816:0, 18:27736,644Пол.ФС (32:0)733,9631+2 Н+8760,859,49–60,16Пол.ФХ (16:0, 18:1)760,0859–9891,1> 60Пол.ФИ (18:0/18:0)867,1513+23 (Na)*Отр. – режим отрицательной ионизации; Пол.
– режим положительной ионизации; ФГ –фосфатидилглицерин; ФС – фосфатидилсерин; ФХ – фосфатидилхолин; ФИ –фосфатидилинозит; Лизо-ФИ – лизофосфатидилинозит.109Рис. 9. Масс-спектры фракции 1 ДНК-связанных липидов P. aurantiaca (режимотрицательной ионизации).Рис. 10. Масс-спектр фракции 2 ДНК-связанных липидов P. aurantiaca (режимотрицательной ионизации).110В отличие от фракции 1, во фракции 2 (время выхода 5,419–6,423 мин)(табл. 6, рис. 10–11) ДНК-связанных липидов были обнаружены только 14:0(m/z 227,1; теор. масса аниона для С14Н27О2 227,3578), 16:1 (m/z 253,3; теор.масса аниона для С16Н29О2 253,4068) и 18:2 (m/z 279,3; теор.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
