Диссертация (1151325), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Саранск) (Ибрагимова и др., 2013;Петров, Зиганшина, 2003; Anderson et al., 1995; Jnaneshwari et al., 2013).Антимутагенный эффект лигандов рассчитывали по формуле:АЭ = (((Ам‒Ак) ‒ (Ал+м‒Ал))/(Ам‒Ак)) ·100, где Ам – уровень микроядер (МЯ),индуцированных мутагеном, Ак (контроль) – уровень МЯ (спонтанныхаберраций), Ал+м – уровень МЯ при обработке тест-объекта лигандом имутагеном, Ал (контроль) – уровень МЯ после обработки клеток лигандом(Бочков и др., 1992; Дурнев, Середенин, 1998).90За 100%-ный антимутагенный эффект принят такой, при которомвеществополностьюнивелируетэффектмутагена(иливыводитопределяемый параметр мутагенности на уровень спонтанного контроля).На рис. 2 представлено содержание лабораторных экспериментов(практическая часть диссертационного исследования).МутагеныГеномЛипидомХимическиеэлементыДНК-связанныелипидыОбщие липидыбактерийАтомноэмиссионнаяспектроскопияГазоваяхроматографияМетиловыеэфиры жирныхкислотМассспектрометрияИндикаторыПОЛМикроядерныйтестЛекарственныесредстваВысокоэффективнаяжидкостнаяхроматографияЛигандыадренорецепторовКомпьютерноемоделированиеСистемаантиоксидантнойзащитыФерментыСпектрофотометрияРис.
2. Содержание лабораторных экспериментов (практическая часть диссертационногоисследования).912.3. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕДля исследований взаимоотношений геномной ДНК и липидов впервой части диссертационной работы мы выбрали клетки прокариот, аименнограмотрицательнуюбактериюPseudomonasaurantiacaиграмположительную бактерию Bacillus subtilis (§ 2.3.1‒2.3.2), и некоторыемодельные системы для исследования в них природы липид-нуклеиновыхвзаимодейстий (§ 2.3.3).Нестабильность геномной ДНК, индуцированная лекарственнымисредствами, представляет научный интерес в связи с интенсивным развитиемфармакологической индустрии и увеличением потребления лекарственныхсредств населением. Таким образом, лекарственные средства (как классксенобиотиков) могут рассматриваться уже в качестве фактора внешнейсреды и становятся угрозой организму человека, его гомеостазу, аллостазу игенетическому аппарату (см.
§ 2.1.5). Изучению генетических эффектовлекарственных средств с мутагенным действием посвящен § 2.3.6, в которомпроведен количественный анализ хромосомных аберраций под влияниемэтих мутагена. Мутагенный эффект лекарственных препаратов может бытьизменен (усилен или ослаблен) с помощью модуляторов липидного обмена ‒лигандовα-иβ-адренорецепторов(эпинефрина,фенилэфрина,орципреналина, пророксана, пропранолола) по рецепторно-регуляторномумеханизму (Семенов, 1997).
Анализу хромосомных аберраций при оценкемутагенного или антимутагенного эффекта этих лигандов в различных дозахпосвящены § 2.3.6 и § 2.3.7. Усиление или ослабление мутагенного действиялекарств-мутагенов – это только одна сторона проблемы. Мутагены могутвлиять не только на геномную ДНК и хроматин, но и на широкий спектрдругих биомакромолекул и систем организма (Середенин, Дурнев, 1992),вчастностинакомпонентылипидома,протеома,транскриптома,метаболома. Ряд ксенобиотиков, в том числе и лекарственные средства,92вызывающиемутации,обладаютоксидантнымиипрооксидантнымисвойствами – это происходит в результате их способности влиять на системуантиоксидантнойзащитыорганизмаииндуцироватьокислительныеповреждения липидов, белков, метаболитов и др.
Поэтому нас заинтересовалвопрос, как канцеростатики с мутагенным действием влияют на процессыперекисного окисления липидов (ПОЛ), количественно оценивая уровеньиндикаторов ПОЛ (гидроперекиси липидов, ГП; диеновые конъюгаты, ДК;малоновый диальдегид, МДА) в крови и органах крыс, а также на активностьферментов антиоксидантной защиты организма (каталазы, пероксидазы,церулоплазмина) и суммарную антиокислительную акивность.
Определениюданных параметров антиокислительной защиты организма при действиимутагена ‒ циклофосфамида ‒ и посвящен § 2.3.4(под действиемциклофосфамида). Поскольку наши эксперименты подтвердили влияниециклофосфамида не только на индикаторы ПОЛ, но и на сопряженную сними активность ферментов антиоксидантной защиты, далее мы исследовалиуровень тридцати макро- и микроэлементов в органах лабораторных крыспод влиянием мутагена циклофосфамида (эти данные представлены в§ 2.3.5). Катионы металлов являются кофакторами ферментов и самиспособны взаимодействовать с ДНК, а некоторые из них представляютэлементы с переменной валентностью (Mo, Fe, Cu, Mn, Cr, Ni, Co и др.), аследовательно, могут индуцировать окислительные повреждения ДНК(Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 1998).932.3.1. ЖИРНОКИСЛОТНЫЕ МАРКЕРЫ ОБЩИХ ЛИПИДОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИЙ В ЗАВИСИМОСТИОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И ФАЗЫ РОСТАДалее мы исследовали взаимосвязь геномной ДНК и фракциипрочносвязанных липидов, на примере прокариотических клеток.
Объектомдля этого исследования выбрали грамотрицательную бактерию Pseudomonasaurantiaca Nakhimovskaya 1948 штамм В-1558, для которой определилилипидный (фосфолипидный) и жирнокислотный состав (ЖК) ДНК-связанныхлипидов (§ 2.3.2). Перед тем как определить ЖК-состав ДНК-связанныхлипидов, мы исследовали и дали сравнительную характеристику ЖК-составаи ЖК-маркеров общих липидов грамотрицательной P. aurantiaca играмположительной Bacillus subtilis OSU-142 бактерий (§ 2.3.1).
Исследовалитакже модельные системы для изучения природы липид-нуклеиновыхвзаимодействий (in silico) (§ 2.3.3).Вработеметодомгазовойхроматографиисиспользованиемстандартного набора жирных кислот и базы данных MIDI исследовалижирнокислотныйпрофиль(МЭЖК)экстрактовобщихлипидовграмположительной бактерии Bacillus subtilis (рис. 3‒4) и грамотрицательнойбактерии P. aurantiaca (рис. 5‒6).2.3.1.1. Жирнокислотные маркеры общих липидов грамположительнойбактерии Bacillus subtilis в зависимости от температуры и фазы ростаДля поиска маркеров фазы роста и влияния температуры намембранные липиды среди ЖК Bacillus subtilis нами был выбран штамм OSU142 (Karlidag et al., 2007; Slabbinck et al., 2009; Tighe et al., 2000).
На рис. 3представленырезультатыопределенияЖКсоставаобщихлипидовграмположительной бактерии B. subtilis OSU-142 в логарифмической фазе(24 ч культивирования) при различных температурах: 24 оС, 28 оС, 34 оС,37 оС и 39 оС, а на рис. 4 ‒ в стационарной фазе (36 ч культивирования). Нарис. 3 приведены величины содержания (свыше 1%) жирных кислот счетным числом атомов углерода ‒ 14:0, 15:0 изо, 15:0 антеизо, 16:0, 17:0 изои 17:0 антеизо, которые составляют свыше 96% ЖК состава общих липидов94известных бактерий. Наибольший уровень характерен для С16 кислот ‒ 15:0изо и 15:0 антеизо (Ибрагимова и др., 2012а).Из данных, представленных на рис. 3, следует, что содержание 14:0кислоты ‒ самое низкое (1‒1,3%) из всех детектируемых жирных кислот (онане определяется уже при 34 оС, 37 оС и 39 оС) (Ибрагимова и др., 2012а).Рис. 3.Влияние температуры на жирнокислотный состав общих липидовграмположительной бактерии Bacillus subtilis штамма OSU-142 в логарифмической фазе(24 ч культивирования). По оси ординат – содержание жирной кислоты, %.
По осиабсцисс – температура, оС, для следующих жирных кислот последовательно: 1 ‒ 14:0, 2 ‒15:0 изо, 3 ‒ 15:0 антеизо, 4 ‒ 16:0, 5 ‒ 17:0 изо, 6 ‒ 17:0 антеизо.Наши данные по составу метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) штаммаOSU-142 при комнатной температуре в целом согласуются с литературнымидля штамма 168 B. subtilis, полученными в широком системном исследованиибактерий пустыни (Roberts et al., 1994). Так, значения для ЖК-состава внаших экспериментах в % (данные работы (Roberts et al., 1994), %)95следующие: 14:0 ‒ 0,71 (1,13); 15:0 изо ‒ 27,68 (29,27); 15:0 антеизо ‒ 41,43(40,19); 16:0 ‒ 10,77 (3,14); 17:0 изо ‒ 11,91 (9,59); 17:0 антеизо ‒ 7, 50 (9,38).Поскольку в нашей работе, как и в работе (Roberts et al., 1994), длякалибровки и анализа образцов использованы система и стандарты MIDI(Kunitsky et al., 2006), мы полагаем, что другие кислоты, обнаруженные висследовании (Roberts et al., 1994) ‒ 16:0 изо, 16:1 цис5, 17:1 цис7 изо, внашем штамме OSU-142 не содержатся.
Авторы другой работы (Li et al.,2010) обнаружили в штамме 168 B. subtilis олеиновую, стеариновую иметилстеариновую кислоты, но не обнаружили изо- и антеизо- изомеров 15:0и 17:0 кислот, которые имеются в липидах данного штамма. Вероятно, этопроизошло потому, что авторы работы (Roberts et al., 1994) не использовалистандарты кислот MIDI системы Sherlock (Kunitsky et al., 2006). Приповышенных температурах культивирования (24 ч) содержание 16:0 кислотысоставляет 5% (37 оС) и 3% (39 оС), в то время как ее содержание при 24 оС,28 оС и 34 оС составляет 8‒14% (Ибрагимова и др., 2012а).В табл.
3 приведены значения содержания разветвленных С16 и С18кислот в профиле МЭЖК общих липидов Bacillus subtilis OSU-142 приразличных температурах и в зависимости от фазы роста. Очевидно, чтосодержание изомера С16 кислоты ‒ 15:0 антеизо ‒ максимально для даннойбактерии и практически не зависит от температуры культивирования, чтосогласуется с ключевой ролью этой кислоты в других бактериях (Annous etal., 1997). Однако содержание 15:0 изо кислоты, оставаясь неизменным(в пределах интервала достоверности, 23‒26%) при 24 оС, 28 оС и 34 оС,увеличивается до 29% при 37 оС и 39 оС. Из данных, представленных на рис. 3,следует, что содержание С18 кислот – 17:0 изо и 17:0 антеизо –с температурой увеличивается: 17:0 изо с 12,5% при 24 оС до 18% при 39 оС, а17:0 антеизо с 8% при 24оС до 12% при 39оС (Ибрагимова и др., 2012а).96Таблица 3Биомаркеры и их соотношение в составе метиловых эфиров жирных кислотобщих липидов штамма грамположительной бактерии B.
subtilis OSU-142при различных температурах и фазах ростаЖирныекислоты15:0 антеизо17:0 антеизо15:0 антеизо /17:0 антеизо15:0 изо /17:0 изо15:0 изо /15:0 антеизо1 7:0 изо /17:0 антеизоФазы роста (содержание ЖК, %)Логарифмическая*Стационарная**28 ºC 34 ºC 37 ºC 39 ºC 24 ºC 28 ºC 37 ºC39,638,036,937,143,542,641,09,59,712,812,26,28,68,54,13,92,93,07,14,94,824 ºC41,47,55,52,31,81,91,71,42,22,21,60,60,60,60,70,70,70,60,71,51,31,41,21,42,31,52,2* 24 ч культивирования.** 36 ч культивирования.Содержание неразветвленных 14:0 и 16:0 жирных кислот в общихлипидах грамположительной бактерии B.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
