Диссертация (1150814), страница 12
Текст из файла (страница 12)
2) свободный PEI в дисперсии полиплекса, данные регистрировались при 40,000 . 3) Исходное распределение PEI ( =40,000 .).Количественное содержание полиэтиленимина было определено на основе абсорбционных иинтерференционных калибровочных кривых, представленных на Рисунке 11 A.
Разница междуколичеством свободного ПЭИ, оцененным по комплексообразованию с сульфатом меди и исходя из экспериментов по скоростной седиментации, составляла менее 10 %. Согласно собранным данным, количество свободного PEI увеличивается с 60.5 % при N/P =6.2 до 90.5% при N/P57.8. Следует отметить, что согласно данным на Рисунке 11 B, фактически, весь ПЭИ связан сДНК только при N/P ≤ 2.5 (CPEI (свободный) = 0 при N/P ≤ 2.5). Такие результаты хорошо коррелируют с данными, полученными Boeckle et al., который показал, что фракционированные по-- 74 липлексы (22 kDa линейный ПЭИ, pCMVluc-плазмиды, N/P = 6) имеют конечное значение N/P =2.5.Рисунок 11.
A – калибровочные кривые для линейного полиэтиленимина, 1 – данные по скоростной седиментации (верхняя ось X), 2 – данные получены спектрофотометрически на λ =285 nm (нижняя ось X); B – Экспериментально определенная концентрация свободного PEI вполиплексной дисперсии после очистки препаративным ультрацентрифугированием (20,000rpm, t = 2 часа) по сравнению с исходной концентрацией PEI при разных соотношениях N/P.В тоже время концентрация связанного ПЭИ в дисперсии может быть рассчитана как разницамежду исходной концентрацией и количеством свободного ПЭИ.
На Рисунке 12 концентрациисвязанного PEI (полые символы соответствуют концентрациям ПЭИ, рассчитанным исходя изпредположения, что при N/P ≤ 2.5 все молекулы PEI связаны, а черные - экспериментальноопределенным значениям) нанесены на график относительно соотношения N/P. Можно четкозаметить две различные области: первая область соответствует отношениям N/P ≤ 2.5, где зависимость имеет линейный характер. Эта область может быть отнесена к процессу образованиякомплексов – избыток свободных мест связывания на ДНК позволяет всем молекулам PEI связываться с ДНК. Вторая область относится к региону с N/P ≥ 6 и может быть достаточно хорошоохарактеризована экспоненциальной функцией с тенденцией к насыщению.
Она описывает поведение связывания молекул PEI с уже сформированными полиплексами. В этом случае десятикратное увеличение общей концентрации полимера приводит лишь к двукратному увеличению количества связанного полимера.- 75 -Рисунок 12. Зависимость концентрации связанного PEI от отношения N / P. Кривая 1) быларассчитана по экспериментально определенным значениям концентрации свободного PEI.Данные аппроксимированы экспоненциальной функцией: y = y0 + Ae-tx, где y0 = 17, A = -13 и t = 0.031; R2 = 0.998.
Кривая 2) соответствует концентрациям PEI, рассчитанным исходя изпредположения, что при N/P ≤ 2.5 все молекулы PEI связаны (Рисунок 11 B).В то же время,как видно из зависимости (Рисунок 12), количество связанного PEI при N/P = 2.5 иN/P = 6 одинаково. Дальнейшее увеличение концентрации связанного PEI появляется толькопри N/P > 6.
Также следует отметить, что размеры конечных комплексов изменяются в достаточно широких пределах – от ~ 800 nm до ~ 300 nm для N/P = 2.5 и N/P = 6, соответственно. Избыток свободного PEI, по-видимому, увеличивает общую стабильность системы и позволяетдальнейшее связывание PEI с ДНК. Из представленной зависимости следует, что даже при высоких соотношениях N/P существуют свободные места связывания на молекуле ДНК. Однаколишь небольшая часть вновь добавленного ПЭИ связывается с ДНК, что приводит к появлениюбольшого количества свободного PEI в дисперсии.
Можно предположить, что в полиплексической дисперсии, выше некоторого отношения N/P (N/P ≈ 2.5), образуется равновесное состояние между связанными и несвязанными молекулами PEI. На основе определенных значенийсвободного PEI были рассчитаны фактические значения отношения N/P (Таблица 1).- 76 Table 1. Количество свободного PEI и фактическое N/PN/Pinitial% PEIN/Pactual2.56.211.628.657.8060.5778590.52.52.42.74.35.2Полученные результаты подтверждают идею, предложенную Clamme et al., что, по сравнению смалыми конденсирующими агентами, PEI конденсирует плазмидную ДНК менее “плотно”вследствие громоздкого каркаса, образованного молекулами PEI. Таким образом, не все заряды ДНК нейтрализуются молекулами PEI.
В подтверждение этой теории было обнаруженоналичие большого количества свободного пространства внутри комплексов PEI/DNA, котороепредположительно занято молекулами растворителя. Молекулярно-динамические моделирование показало, что линейный ПЭИ связывается с ДНК более эффективно, по сравнению с разветвленным, что приводит к вытеснению большего количества воды. С другой стороны, линейный ПЭИ обеспечивает лучшее покрытие поверхности ДНК, что в свою очередь ограничиваетколичество молекул PEI, которые могут взаимодействовать с ДНК.Далее, соотношение молярных концентраций связанного PEI с ДНК позволяет рассчитать количество индивидуальных макромолекул PEI, связанных с одной ДНК.
Данные представлены вТаблице 2. Молярная масса комплексов ДНК/PEI может быть рассчитана по уравнениюСведберга, используя определенные коэффициенты седиментации и фрикционные отношения(f/fsph). Полученные значения, особенно в области малых / (1 < / < 3), огромны и достигают значений порядка 330×109 g mol-1. При самом высоком соотношении / = 57.8, молярная масса комплекса примерно на два порядка ниже, но по-прежнему составляет ≈0.6×109 gmol-1.Найденное количество связанных молекул PEI с ДНК позволяет рассчитать общую молярнуюмассу отдельных конденсированных молекул ДНК (MДНК +МPEI). Суммарная молярная масса молекулы, конденсированной ДНК, увеличивается незначительно при росте отношения N/P и составляет всего ≈ 4.37×106 g mol-1при наивысшей концентрации PEI (Таблица 2). Таким образом,количество молекул ДНК в одном полиплексе можно оценить как:=полиплекс+- 77 Очевидно, что даже при высоких соотношениях N/P число молекул ДНК в одном полиплексебудет довольно большим (Таблица 2).
Так, при N/P = 28.6, полиплексы с размерами 170 nm состоят в среднем из 180 ДНК-плазмид и 88 молекул ПЭИ, тогда как 320 nm полиплекс при N/P =6.2 состоит из 3,600 плазмид и 50 молекулам ПЭИ.Таблица 2. Молярная масса и гидродинамический размер полиплексов, масса ДНК со связанными молекулами PEI, а также количество индивидуальных молекул ДНК в единичном полиплексе.N/PMполплекс∙10-9,g∙mol-1MДНК+PEI∙10-6,g∙mol-12.56.211.628.657.8~33013.01.900.740.573.633.633.684.144.37№ связанныхPEI50505488105Nd, nm91,0003,600520180130~1,000320210170100Это объясняется достаточно высокой агломерацией первоначально сформированных комплексов. Тем не менее, изображения микроскопии при различных соотношениях N / P указывают наприсутствие небольших частиц с размерами = 50 ± 10 (Рисунок 8), которые не проявляются в виде отдельных пиков в распределениях, полученных методом скоростной седиментации.
Коэффициенты седиментации, соответствующие комплексам с размерами ~50 , должны иметь величину, примерно, 1500 ± 500 S. В зависимости от образца, относительное количество полиплексов с такими коэффициентами седиментации составляет от ~ 3 % до 12 %. Молярная масса комплексов таких размеров, в этом случае, составляет = (80 ± 50) ×106 −1. Поскольку молярная масса ДНК плюс PEI существенно не изменяется при / >2, для расчетов использовалось среднее значение ≈ 3.96 × 106 −1 .
Исходя из этихданных, один полиплекс размером 50 ± 10 состоит из 8 – 33 конденсированных молекулДНК и 70 – 25 молекул PEI. В литературных данных приводятся различные сведения о числе индивидуальных ДНК-плазмид в одном полиплексе. Ранее было показано, что полиплексы на основе разветвленного PEI состоят в среднем из 3.5 плазмид, тогда как тороидальные комплексыДНК, образованные при взаимодействии с многовалентными катионами, содержат ≈ 13 плазмид.165-166В дополнение к изучению физико-химических свойств, была исследована эффективностьтрансфекции полиплексов при различных соотношениях N/P (Рисунок 13).- 78 -Рисунок 13. Влияние ПЭИ 13.4 kDa на эффективность трансфекции и общую массу белка взависимости от разных отношений N/P, клетки CHO-K1. Белые полосы показывают экспрессию гена - репортёра как RLUs μg-1 белка, в то время как черные точки представляют общую массу белка.
Каждая точка данных представляет собой среднее значение трех независимо обработанных клеточных лунок.Как видно из Рисунка 13, адекватные уровни трансфекции достигаются только при соотношениях / ≥ 10, что хорошо согласуется с литературными данными. Yue et al. предположили,что избыток несвязанного PEI влияет не только на стабильность и размер полиплекса, но, вероятно, также улучшает клеточное поглощение полиплекса за счет еще неопределенных взаимодействий между катионными группами и отрицательно заряженной клеточной мембраной.
Вдополнение к улучшению уровня трансфекции, эти взаимодействия также ответственны за цитотоксичность катионных полимеров, что также можно наблюдать в наших экспериментах. Посравнению с необработанными клетками, общая масса белка при / = 25 снижена, что является показателем цитотоксичности, вызванной высокой концентрацией несвязанного PEI (Рисунок 13).Общая стабильность дисперсий комплексов ДНК/ПЭИ была изучена методом скоростной седиментации. На Рисунке 14 показано сравнение исходного распределения коэффициентов седиментации с распределением, полученным через три дня.- 79 -Рисунок 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
