Диссертация (1150814), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Седиментационные профили (с = 3.5 × 10−5 −3) (в верхней части рисунка) идифференциальные распределения коэффициентов седиментации (в нижней части рисунка)ДНК pGL3, в 0.05 , вода, 7.4.Формирование и свойства полиэлектролитных комплексов ДНК/ПЭИ были исследованы приразличных отношениях N/P. Отношение массы к числу зарядов ДНК равно одному анионномузаряду (P) на 330 g mol-1, тогда как PEI имеет один катионный заряд на 44 g mol-1.
Соответственно, для приготовления полиплексов при N/P = 1, на 1 µg ДНК требовалось 0.13 µg ПЭИ. Полиплексы формировались и изучались в водном 0.05 M NaCl и pH = 7.4. Добавление небольшогоколичества PEI к раствору ДНК (N/P < 1) приводит к увеличению среднего значения коэффициента седиментации, а также уширению общего распределения (увеличению дисперсности) (Рисунок 4.).- 67 -Рисунок 3. Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации (A) и концентрационные зависимости коэффициентов седиментации и фрикционных отношений длялинейного полиэтиленимина, в 0.1 , вода, = 20 ℃.Рисунок 4.
Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации комплексовДНК/ПЭИ при отношениях / < 1, в 0.05 , вода, = 7.4.Средний коэффициент седиментации увеличился с ≈ 20 для свободной ДНК, до значения ≈160 при / = 0.96. Увеличение кажущегося коэффициента седиментации указывает на частичное компактизирование цепочек ДНК за счет компенсации электростатических зарядов наДНК, а также в следствие увеличения размера комплекса за счет гидрофобных взаимодействий.- 68 Кроме того, анализ распределений при / < 1 показал наличие в растворе нескольких фракций, которые могут быть отнесены к свободной или не полностью “комплексной” ДНК со средним коэффициентом седиментации 24.0 ± 0.5 и уже сформировавшихся первичных полиплексов с коэффициентом седиментации 220 ± 80 .Результаты анализа комплексов методом гель-электрофореза (Рисунок. 5) показывают, что всяДНК оказывается связанной с ПЭИ при / ≈ 2, что хорошо согласуется с литературными данными.Рисунок 5.
Результаты экспериментов гель-электрофореза с комплексами ДНК/ПЭИ приразличных отношениях N/P.Дальнейшее увеличение концентрации PEI в растворе ДНК (1 ≤ / ≤ 4) приводит к слиянию первоначально сформировавшихся полиплексов и образованию частиц с гораздо большими размерами – такая агломерация напрямую связана с нейтрализацией поверхностного заряда полиплекса при относительно низких соотношениях N/P. Соответственно, было зафиксировано увеличение среднего коэффициента седиментации до значений порядка ≈ 300,000 при/ = 2.06.
Дальнейшее увеличение содержания ПЭИ приводит к уменьшению среднего коэффициента седиментации и стабилизации комплекса в растворе, за счет увеличения поверхностного заряда частиц в растворе. На Рисунке 6 A представлены распределения коэффициентов седиментации при / ≥ 4. Следует также отметить, что распределения в большинствеслучаев состояли из основного пика (~80 % от общей массы) и набора второстепенных пиков- 69 или “хвоста” в высокомолекулярной области. Зависимость среднего коэффициента седиментации от величины отношения / показано на Рисунке 6 B.Рисунок 6.
Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации комплексовДНК/ПЭИ при отношениях / ≥ 4, в 0.05 , вода, = 7.4.Взаимодействие ДНК с ПЭИ и последующее образование комплекса, приводят к изменениямеё фрикционных свойств – коэффициента поступательного трения. В этом случае асимметриюконечного комплекса можно оценить по установленному значению фрикционного отношения –/ℎ . Анализ отношения /ℎ проводили с использованием моделей () и (, /ℎ)имплементированных в программное обеспечение . При значении /ℎ = 1 коэффициент поступательного трения изучаемого объекта/макромолекулы будет соответствовать коэффициенту трения сферической частицы, имеющей туже массу и плотность; т.е.
чем выше значение /ℎ , тем выше асимметрия исследуемых комплексов. На Рисунке 7 A показано оцененное фрикционное отношение, как функция от /. Как можно видеть из представленнойзависимости, существует явная тенденция уменьшения /ℎ с увеличением отношения /,связанная с образованием более компактных и однородных комплексов ДНК/ПЭИ. Значение 1было достигнуто при / ≈ 2 и оставалось неизменным, в пределах экспериментальной погрешности при больших отношениях /.
Для более детальной интерпретации седиментационных данных, в частности, численной оценки молярной массы и гидродинамических размеров, должен быть известен удельный парциальный объем () комплексов ДНК/ПЭИ.- 70 -Рисунок 7. A – Зависимость фрикционного отношения /ℎ от отношения N/P для комплексов ДНК/ПЭИ.
B – Зависимость гидродинамического размера комплексов ДНК/ПЭИ ототношения N/P.Удельный парциальный объем комплексов был определен из эксперимента по скоростной седиментации в идентичных растворителях различающихся плотностью – H2O и D2O. Средние коэффициенты седиментации составили 27,800 и 33,900 для растворов полиплекса в D2O иH2O, соответственно, приводя к удельному парциальному объему = 0.50 ± 0.01 3 −1 .Интересно отметить, что комплексообразование ДНК с ПЭИ не привело к существенному изменению исходного значения удельного парциального объема ДНК, равного 0.54 3 −1 . Средний гидродинамический размер полиплекса может быть посчитан с использованием известныхзначений коэффициента седиментации, фрикционного отношения и удельного парциальногообъема, используя соотношение 1.2.13. На Рисунке 7 B средний гидродинамический размерпредставлен как функция отношения N/P. При относительно низких соотношениях N/P (≤ 1)гидродинамический размер объектов уменьшается в результате компактизации молекулы ДНК.Минимальное значение ≈ 29 достигается при / ≈ 0.5.
Увеличение отношения N/P до 1приводит к небольшому увеличению размера полиплексов, достигающего, примерно, 33 .Образование крупных агрегатов с размерами порядка 1,000 происходит при / ≈ 2.Дальнейшее увеличение концентраций ПЭИ в растворе приводит к плавному уменьшению- 71 средних размеров частиц. При / ≥ 10 полиплексы имеют средний размер около 170 ±60 . Морфология полученных комплексов была изучена сканирующей силовой микроскопией (Рисунок 8). Результаты хорошо коррелирует с экспериментальными данными, полученными из электрофореза и скоростной седиментации, и показывают частичное комплексообразование ДНК и уже сформированные первичные комплексы при низком соотношении /~0.7(Рисунок 8 A). При увеличении концентрации PEI до / ≈ 4.5 наблюдается слияние первоначально сформированных комплексов в крупные агрегаты (Рисунок 8 B). Как и ожидалось, дальнейшее увеличение содержания ПЭИ (/ = 28.6) привело к образованию более стабильныхполиплексов с меньшими средними размерами около 200 nm.
В тоже время видно присутствиебольших агрегатов с широким распределением по размеру и средний размер (Рисунок 8 C).Следует также отметить наличие мелких частиц размером ~ 50 которые хорошо видны наРисунке 8 D. Поскольку SFM-изображения были получены для образцов осажденных из раствора на подложку высота структур оказывается меньше, чем ожидалась, вследствие коллапсасферических агрегатов при сушке. Однако поперечные размеры частиц хорошо соотносятся срезультатами, полученными из скоростной седиментации. Несколько предыдущих исследований показали, что значительная часть молекул ПЭИ находится в свободной форме. Так, Clammeet al. показал, что порядка 86 % молекул разветвленного ПЭИ (25 ) находятся в не связанном состоянии при комплексообразовании (/ = 6 и 10) с молекулой ДНК (3, 5.1 ).
Вто время как Yue и коллеги показали, что концентрация ПЭИ в растворе, после удаления частицполиплекса фильтрованием, составляет порядка 69 % от его начальной концентрации (25 разветвленный ПЭИ, ДНК 3 5.3 , / 10). Вследствие того, что заряд этих свободныхмолекул ПЭИ не экранирован, они обладают повышенной токсичностью. В тоже время, свободные цепи ПЭИ, по-видимому, играют жизненно важную роль при процессах трансфекции.- 72 -Рисунок 8.
Микроскопические изображения комплексов ДНК/ПЭИ при различных отношенияхN/P: N/P 0.68, B) N/P 4.45, C, D) N/P 25 и E) соответствующий двумерный профиль изображения D.Поэтому, используя комбинацию аналитического и препаративного ультрацентрифугирования,содержание свободного ПЭИ в растворе было определено при различных отношениях N/P(6.2, 11.6, 28.6, 57.8). Определение свободного полиэтиленимина проводилось путем анализанадосадочной части раствора, после удаления сформировавшихся комплексов препаративнымцентрифугированием в течении 2 часов при 20,000 .
В очищенный от сформировавшихсякомплексов раствор добавляли сульфат меди (CuSO4), который при взаимодействии с ПЭИ образует комплекс, имеющий четкую полосу поглощения на λ = 285 nm. Более того, при относительно высоких концентрациях ПЭИ, его свободное содержание в растворе может быть опре-- 73 делено исходя из экспериментов по скоростной седиментации, выполненной при разных скоростях ротора.
Анализ комплексов проводили при относительно малых скоростях ротора( = 1,000 – 5,000 ), в то время как полиэтиленимин начинает седиментировать толькопри > 40,000 . На Рисунке 10 представлены результаты такого эксперимента: распределение, полученное для низкомолекулярной фракции, седиментирующей при n = 40,000 rpm,совпадает с распределением исходного полиэтиленимина.Рисунок 10. Определение свободного PEI в полиплексной дисперсионной среде (/ = 28.6). 1)Полиплексы, данные регистрировались при 1,000 .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
