Автореферат (1150380), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Наилучшийрезультат по степени извлечения был достигнут прииспользовании 15% ПФОС в0.5% водном растворе пиперидина (это означает 15%-е содержание раствора перфтороктановой сульфокислоты вметаноле (концентрация 1 мг/мл) в 0.5% водном растворе пиперидина). МолекулаПФОС содержит большое количество атомов фтора, а также богатую атомами кислорода сульфогруппу, имеющих высокое сродство к атомам железа по принципу Пирсона, что, по-видимому, способствует вытеснению пептида за счет более прочного13связывания с сорбентом. При использовании 0.5% водного раствора пиперидина бездобавок удалось достигнуть степени извлечения лишь 63%. Таким образом, по результатам исследования для увеличения степени извлечения фосфорилированныхпептидов была предложена методика последовательного элюирования 0.4 М воднымраствором аммиака, 0.5% водным раствором пиперидина и, затем, 15% растворомПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина.Изучение специфичности сорбции на примере смеси различных фосфорилированных пептидовСледующим шагом стало исследование более широкого круга пептидов, аименно: смесь8 пептидов-фрагментовтау-белка,SSNGHV(pY)EKLSSI,FGE(pS)AGAAS, FGESAGAAS, взятых в равных количествах (таблица 5).
В качествесорбента сравнения был выбран коммерческий железосодержащий Iron Affinity Gel.Все сорбенты были взяты в равных количествах по сухой массе.№ Аминокислотная последовательность пептидаpI[M+H]+1SRTPSLPTPPTREPK10.83 1663.9131pSRpTPSLPTPPTREPK7.07 1743.8791ppSRpTPpSLPTPPTREPK5.05 1823.8462VAVVRTPPKSPSSAK11.17 1523.8912pVAVVRpTPPKSPSSAK8.67 1603.8572ppVAVVRpTPPKpSPSSAK6.98 1683.8243TDHGAEIVYKSPVVSGDTSPR5.35 2215.1003ppTDHGAEIVYKpSPVVSGDTpSPR4.03 2375.0324FGESAGAAS4.00 796.3454pFGEpSAGAAS3.30 876.3145pSSNGHVpYEKLSSI7.82 1500.673МХС Fe(III)МОС Fe(III)Таблица 5 – Набор исследованных синтетических пептидовIron Affinity GelРисунок 10 – Диаграммы степеней извлечения синтетических пептидов после металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III), МОС Fe(III) и Iron Affinity GelАнализ, проведенный методом металл-аффинной хроматографии в оптимизированных условиях с последующим ВЭЖХ-МС детектированием показал, что оба исследуемых сорбента демонстрируют высокую селективность к фосфорилированнымпептидам (1р, 1рр, 2р, 2рр, 3рр, 4р, 5р) по сравнению с нефосфорилированными (1, 2,3, 4) (рисунок 10).
Хорошо видно, что последние практически отсутствуют в элюате,тогда как первые имеют сравнительно высокую степень извлечения. При этом существует четкая обратная зависимость между pI пептида и его степенью извлечения.Например, в ряду 2->1->3->4 чем ниже pI, тем выше степень извлечения, а значит иих неспецифическая сорбция. В ряду 2рр->1рр->3рр наблюдается схожая корреляциядля МХС Fe(III) и обратная для МОС Fe(III). Это может быть обусловлено большимсродством МХС Fe(III) к анионным пептидам по сравнению с МОС Fe(III).
Следуетотметить также более высокую специфичность сорбции дифосфорилированных пеп-14тидов по сравнению с монофосфорилированными, причем особенно значимо это проявляется при использовании МХС Fe(III).Сорбент сравнения в целом проявляет аналогичную специфичность по отношению к разной степени фосфорилирования каждого пептида, однако, степени извлечения при его использовании существенно ниже.Металл-аффинная хроматография триптического гидролизата казеинаКазеин является нативно фосфорилированным белком, и поэтому его удобноиспользовать в качестве модельного объекта для металл-аффинной хроматографии.Поскольку содержание фосфорилированных пептидов в его триптическом гидролизате составляет не более 5% от общего числа пептидов (а нефосфорилированные пептиды способны неспецифично сорбироваться за счет других кислотных функциональных групп), необходимо использовать достаточное количество сорбента, чтобы избежать его пересыщения.
Был проведен ряд экспериментов по подбору оптимальногосоотношения сорбент:аналит, оказавшегося равным 310:1. Для одного из фосфорилированных пептидов (FQ(pS)EEQQQTEDELQDK), было проведено сравнение степениизвлечения при параллельном и последовательном элюировании тремя растворителями (0.4М водный раствор аммиака, 0.5% водный раствор пиперидина, 15% ПФОС в0.5% водном растворе пиперидина, детектирование пептида методом ВЭЖХ-МС, рисунок 11).АБРисунок 11 – Диаграммы степеней извлечения пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK в различныхфракциях при проведении металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III) и МОС Fe(III): А – последовательное элюирование; Б – параллельное элюированиеКак в случае МХС, так и в случае МОС суммарная степень извлечения пептида,фосфорилированного по серину, при последовательном элюировании превышает степень извлечения при элюировании любым из растворителей, поскольку при такомподходе процесс десорбции проходит с участием различных механизмов.АРисунок 12 – Диаграмма степеней извлеченияпептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK при проведении металл-аффинной хроматографии наМХС Fe(III), МОС Fe(III) и Iron Affinity GelПосле установления оптимальных условий десорбции фосфорилированных пептидов, следующим этапомстало проведение металл-аффиннойхроматографии триптического гидролизата казеина на трех сорбентах(МХС Fe(III), МОС Fe(III) и сорбентсравнения PHOS-Select™ Iron Affinity15Gel).
Для пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK степени извлечения на изучаемых сорбентах составили 70-80% при низких потерях вследствие неудерживания (проскок)или сильного удерживания (потери) на сорбенте (рисунок 12). Более того, в случаепептида TVDME(pS)TEVFTK степень извлечения достигла 95%. Коммерческий сорбент продемонстрировал крайне низкие степени извлечения.Стоит заметить, что все сорбенты были взяты в равном количестве по массе, вслучае коммерческого сорбента это количество было меньше рекомендованного производителем.
Однако, даже при существенном увеличении количества коммерческогосорбента степень извлечения не превысила значения для МХС Fe(III) и МОС Fe(III)(рисунок 12.А). Это говорит о более эффективном выделении фосфорилированныхпептидов на разработанных сорбентах.Выделение пептидов альбумина, модифицированных остатком заринаВ последние годы успешно проводятся работы по разработке методик извлечения из биологических образцов фосфонилированных пептидов с использованием метода металл-аффинной хроматографии. Одним из применяемых в этих целях сорбентов является коммерческий гель PHOS-Select™ Iron Affinity Gel, содержащий железо(III).
Следовательно, можно было ожидать, что МХС Fe(III) и МОС Fe(III) такжеспособны селективно сорбировать из сложных смесей не только фосфорилированные,но и фосфонилированные пептиды.ВБРисунок 13 – Масс-спектр образца, содержащегогидролизат сывороточного альбумина человека, обработанного зарином в концентрации 0.1 мг/мл: А –до металл-аффинной хроматографии; Б – после металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III)(элюирование 0.5% водным раствором пиперидина);В – после металл-аффинной хроматографии на МОСFe(III) (элюирование 15% ПФОС в 0.5% водномрастворе пиперидина)В пептическом гидролизате сывороточного альбумина человека, модифицированного зарином, могут присутствовать двапептида, содержащие тирозин-411, модифицированный остатком зарина (сдвиг массыА относительно нативных пептидов составляет 120 Да): LVRYзаринTKKVPQVST (m/z1638.9) и VRYзаринTKKVPQVST (m/z1525.8) Следует отметить, что при низкойинтенсивности искомых сигналов в массспектре гидролизата (рисунок 13.А), послеметалл-аффинной экстракции сигналы, соответствующие аддуктам, становятся мажорными компонентами спектра (рисунок 13.Б).
Наличие модификации в пептидахбыло доказано методом тандемной масс-спектрометрии по отщеплению нейтральнойчастицы. Практически полное отсутствие примесных сигналов свидетельствует о высоком уровне специфичности МХС Fe(III) к фосфонилированным пептидам. Аналогичные результаты были получены и при использовании МОС Fe(III), элюент – 15%ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина.Выводы1. Впервые показана возможность использования коллапсированных монослоевпленок Ленгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(III) – МХС Fe(III) – в качествесорбентов для металл-аффинной хроматографии.2. Впервые золь-гель методом с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением, были получены наноразмерныеVRYTKKVPQVSTзаринLVRYTKKVPQVSTзарин16структуры на основе оксида железа(III) – МОС Fe(III).
Установлено, что размер полученных частиц составляет 50-100 нм. Показана возможность их использования в качестве металл-аффинных сорбентов.3. Изучены структуры поверхности сорбентов методом сканирующей электронной микроскопии. Определены физико-химические свойства полученных структурМХС Fe(III) и МОС Fe(III): удельная поверхность (15 и 60 м2/г соответственно), изоэлектрическая точка (рН 3.5 и 5.5 соответственно).4. Определена сорбционная емкость МХС Fe(III) и МОС Fe(III) по пептидуSSNGHV(pY)EKLSSI (0.035 и 0.019 мкмоль/мг соответственно), изучены изотермысорбции белка казеина быка (casein Bos Taurus) и фосфорилированных пептидов, показано, что они соответствуют теории Ленгмюра.5.
Оптимизированы условия выделения фосфорилированных пептидов с цельюповышения селективности анализа. Показано, что добавление перфтороктановойсульфокислоты к элюенту приводит к улучшению десорбции фосфорилированныхпептидов с разработанных сорбентов и, соответственно, повышению степени их извлечения.6. Показана возможность использования разработанных сорбентов в фосфопротеомном анализе, исследованы специфичность и селективность сорбентов на примерефосфорилированных триптических пептидов казеина быка и синтетических пептидов,фосфорилированным по различным аминокислотам.
Показано, что разработанныесорбенты обладают высокой селективностью и могут быть применены для анализабиологических образцов.7. Впервые показана возможность селективного выделения аддуктов зарина спептидами сывороточного альбумина человека методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих железо(III).Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:1. Гладилович В.Д., Федорова А.В., Подольская Е.П. Металл-оксидный сорбентна основе Fe2O3. Получение, изучение поверхностных и сорбционных свойств //Научное приборостроение.
2013. Т. 23. N 4. С. 63-65.2. Кельциева О.А., Гладилович В.Д., Прусаков А.Н., Колоницкий П.Д., Суходолов Н.Г., Селютин А.А., Краснов Н.В., Бонитенко Е.Ю., Подольская Е.П. Регулярные мультимолекулярные сорбенты (МХС). Получение, изучение поверхностных исорбционных свойств // Научное приборостроение. 2012. Т.
22. N 4. С. 50-55.3. Гладилович В.Д., Шрейнер Е.В., Дубровский Я.А., Колоницкий П.Д., Краснов К.А., Бабаина Е.В., Мурашко Е.А., Бабаков В.Н., Кельциева О.А., Краснов И.А.,Ануров М.С., Русских Я.В., Чернова Е.Н., Жаковская З.А., Суходолов Н.Г., СелютинА.А., Александрова М.Л., Подольская Е.П. Исследование специфичных свойств регулярного мультимолекулярного сорбента Fe(III) // Научное приборостроение.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
