Автореферат (1150380), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Результаты исследования процесса сорбции фосфорилированных пептидов ибелка на полученных сорбентах.5. Результаты экспериментального исследования селективности и специфичности сорбции фосфорсодержащих пептидов из простых и сложных пептидных смесейпри использовании предлагаемых сорбентов.Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех разделов,заключения, списка литературы и приложения. Она изложена на 116 страницах ивключает 37 рисунков, 25 таблиц, 114 наименований списка литературы и 1 приложение.Основное содержание диссертационной работыВо введении изложен краткий обзор проблемы и постановка задачи.Первый раздел содержит обзор литературы, включающий общие сведения ометоде металл-аффинной хроматографии, принципе его действия и применении его вфосфопротеомных исследованиях, критическое рассмотрение существующих сорбентов для металл-аффинной хроматографии.
Рассмотрены особенности пленокЛенгмюра-Блоджетт и области их применения.Во втором разделе подробно описаны условия проведенных экспериментов испособы обработки полученных данных. Представлены: а) методика получения металл-хелатного сорбента, содержащего железо(III) – МХС Fe(III); б) методика синтезаметалл-оксидного сорбента, содержащего железо(III) – МОС Fe(III); в) методикистандартизации сорбентов; электрокинетических исследований сорбентов; определения их удельной поверхности; построения изотерм сорбции белка и фосфорилированных пептидов, определения сорбционной емкости сорбентов и расчета термодинамических характеристик; д) методика проведения металл-аффинной хроматографиив двух вариантах аппаратурного исполнения (в микропробирке на 0.5 мл и в спиновойколонке); е) условия масс-спектрометрического и хроматографического анализа(MALDI-масс-спектрометрический анализ проводили с помощью времяпролетногомасс-спектрометра Axima Performance (Shimadzu, Япония); хроматографический анализ методом ВЭЖХ-УФ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20«Prominence» (Япония) с УФ детектором с диодной матрицей SPD-M20A; хроматомасс-спектрометрический анализ методом ВЭЖХ-МС проводили на системе, состоящей из жидкостного хроматографа Waters Alliance 2695 с масс-спектрометром PESciex API QSTAR; хроматомасс-спектрометрический анализ методом ВЭЖХ-МС-МСпроводили на системе, состоящей из жидкостного хроматографа Waters Acquity UPLCс масс-спектрометром Orbitrap (Thermo Scientific).В третьем разделе представлены и обсуждены результаты работы.Разработка металл-аффинного сорбента на основе пленок ЛенгмюраБлоджетт, состоящих из стеарата железа(III)6ПЛБ на основе стеарата железа(III) получали следующим образом: в специальной ванне на поверхность водной субфазы, содержащей ионы железа(III), наносилипо каплям раствор стеариновой кислоты в гексане.
После испарения гексана с воднойсубфазы на ее поверхности образовывался мономолекулярный слой, состоящий изпродуктов взаимодействия стеариновой кислоты с ионами железа(III). После коллапсирования монослоя была получена многослойная структура, которую переносили вмикропробирку. Для определения структурных звеньев был проведен MALDI-массспектрометрический анализ ацетонитрильной суспензии коллапсированных монослоев. В масс-спектре, полученном в режиме положительной ионизации, был найденинтенсивный сигнал с m/z 622.46, соответствующий дистеарату железаFe(C17H35COO)2+, что подтвердило имеющиеся литературные данные. Необходимоподчеркнуть, что не были обнаружены сигналы, соответствующие тристеаратамжелеза. Это позволяет предположить возможность взаимодействия иона железа (в силу его стерической доступности) с различными гетероатомами органическихсоединений согласно принципу Пирсона.В связи с особенностями метода получения ПЛБ можно с высокой точностьюзадать площадь, занимаемую пленкой, но не ее массу.
Определение точной массымонослоя заданной площади позволяет вычислять массу пленок по площадиполученного монослоя. По результатам стандартизации масса сухих коллапсированных ПЛБ на основе стеарата железа(III) составляет 0.028 ± 0.001 мг/дм2.Рисунок 1 – Изображение структуры коллапсированных ПЛБ на основе стеарата железа(III), перенесенных на кремниевую подложку, полученное методом СЭМ, увеличение в 1000 раз (слева) и 1965раз (справа)С помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на растровомэлектронном микроскопе Inspect S (FEI, США) была исследована структура поверхности коллапсированных ПЛБ на основе стеарата железа(III) на кремниевой подложке(рисунок 1).
Так как сжатие монослоев происходило в двух направлениях, видна зигзагообразная складчатость. Однако при более сильном увеличении видно образованиефрагментов с гладкой поверхностью, доступной для сорбции.Исследование процесса сорбции фосфорилированного белка на пленкахЛенгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(III) методом атомно-силовоймикроскопииПри помощи атомно-силового микроскопа Ntegra Aura (NT MDT, Россия) былипроведены исследования процесса сорбции фосфорилированного белка казеина (casein Bos Taurus, молекулярная масса 18 кДа) на ПЛБ на основе стеарата железа(III),перенесенных на твердую подложку.На рисунке 2.А представлено изображение поверхности чистой кремниевойподложки.
На нее были нанесены ПЛБ на основе стеарата железа(III) (рисунок 2.Б).При сравнении рельефов видно, что ПЛБ были успешно перенесены на подложку, таккак резко уменьшилась шероховатость поверхности. Затем подложка была помещенав водный раствор казеина (концентрация 100 мкг/мл) на сутки, после чего была про-7мыта дистиллированной водой для удаления непрореагировавшего с поверхностьюказеина (рисунок 2.В).
На поверхности ПЛБ видны участки, на которых произошлаадсорбция агрегатов казеина, со средними размерами 200-500 нм. Затем для десорбции казеина подложка была помещена на 1 час в 0.4 М водный раствор аммиака (рисунок 2.Г). Все ранее адсорбированные частицы, отнесенные к агрегатам казеина, были удалены с поверхности ПЛБ полностью. Успешная сорбция и десорбция фосфорилированного белка в условиях, соответствующих классическому металл-аффинномуанализу, доказывает возможность использования исследуемых ПЛБ в качестве металл-аффинного сорбента.АВБГРисунок 2 – Изображения, полученные методом атомно-силовой микроскопии: А – чистая кремниевая подложка; Б – подложка с нанесёнными ПЛБ на основе стеарата железа(III); В – подложка с ПЛБс нанесёнными молекулами казеина; Г – подложка с ПЛБ с нанесённым белком после промывки0.4 М водным раствором аммиакаТаким образом, полученные ПЛБ на основе стеарата железа(III) можно условнообозначить как металл-хелатный сорбент, содержащий железо(III) – МХС Fe(III).Разработка металл-аффинного сорбента на основе оксида железа(III)Для синтеза оксида железа(III) был использован модифицированный золь-гельметод соосаждения аморфного прекурсора с дальнейшим самораспространяющимсясинтезом, индуцированным микроволновой термообработкой с частотой 2.45 ГГц.Уравнение реакции:2 Fe(NO3)3 + 3 NH2CONH2 → Fe2O3 + 6 N2O +3 CO2 + 6 H2OПри температуре синтеза (120-150С) все продукты реакции, за исключениемоксида металла, являются газообразными и удаляются из реакционной смеси (в процессе синтеза).
Получение оксидов в таких неравновесных условиях обеспечивает пористую структуру и малый размер образующихся частиц. Фазовый состав полученных образцов был определен методом рентгенофазового анализа на дифрактометреДифрей 401 (Научные приборы, Россия), который подтвердил наличие исключитель-8но рефлексов отражений, соответствующих структуре α-Fe2O3, это означает, что препарат представляет собой чистый оксид железа(III).Определение размеров частиц полученного оксида железа(III)Определение размеров частиц препарата оксида железа(III) было проведено методом сканирующей электронной микроскопии (рисунок 3).Рисунок 3 – Изображение образца оксида железа(III), полученное методом СЭМ, увеличение в 5068раз (слева) и 15000 раз (справа)Согласно полученным данным, образец представляет собой пористую структуру с размером частиц порядка 50-100 нм, которые образуют более крупные агломераты (рисунок 3).Исследование сорбции фосфорилированного пептида на оксиде железа(III)методом MALDI масс-спектрометрииМеталл-аффинная хроматография в основном применяется в биоорганическоманализе, а именно в такой области, как фосфопротеомика, где объектами исследования являются фосфорилированные пептиды с молекулярными массами от 500 до3000 Да, полученные в результате ферментативного гидролиза белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
