Автореферат (1150380), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Поэтому в качестве модельного объекта был выбран фосфорилированный пептид с аминокислотной последовательностью SSNGHV(pY)EKLSSI и молекулярной массой 1499 Да. Было проведено исследование возможности его выделения из водного образца на полученном оксиде железа(III).ВРисунок 4 – MALDI масс-спектры пептида SSNGHV(pY)EKLSSI: А – исходный образец, Б – промывка 0.1% ТФУ, В – элюат 0.4M NH4OHСорбцию пептида проводили в кислой среде (0.1% водный раствор трифторуксусной кислоты), десорбцию проводилиБ с помощью увеличения рН – 0.4 М водным раствором аммиака.В масс-спектре экспериментального образца, полученного послеэлюирования раствором аммиака был детектирован сигнал, соответствующий протонированной форме пептида (m/z 1500.3).
ВА масс-спектре промывки практически отсутствуют сигналы исследуемого пептида (рисунок 4).Таким образом, эксперимент, выполненный в таких условиях, полностью доказывает возможность использования синтезированного нанодисперсного оксида железа(III), в качестве металл-оксидного сорбента (МОС Fe(III)).Определение изоэлектрической точки сорбентовОдним из параметров, характеризующих свойства поверхности, является электрокинетический потенциал (ζ-потенциал). Для МХС Fe(III) и МОС Fe(III) были исследованы электрокинетические свойства при концентрации индифферентного фоно-9вого электролита (KCl) 10-3 моль/л на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments,Великобритания) (рисунок 5).
Электрокинетический потенциал рассчитывали поформуле Гельмгольца-Смолуховского без введения дополнительных поправок.Рисунок 5 – Зависимость электрокинетическогопотенциала МХС Fe(III) и МОС Fe(III) от рНраствораВ кислой области (рН 1.5-3) поверхность заряжена положительно, наповерхности образуется катион FeSt2+.По мере уменьшения кислотности средыположительный заряд уменьшается истановится равен нулю при рН 3.5 (изоэлектрическая точка). При дальнейшемуменьшении кислотности наблюдаетсярост отрицательного заряда поверхностиза счет образования гидратных формионов. В случае МОС Fe(III) из рисунка 5 можно определить его изоэлектрическуюточку – около рН 5.5.Таким образом, был сделан вывод, что МХС Fe(III) и МОС Fe(III) можно применять в кислой области рН, поскольку в этом случае поверхность сорбента заряженаположительно, а оптимальными условиями сорбции на исследуемых структурах будут растворы с рН < 3.Определение удельной поверхности МОС Fe(III)Удельная поверхность является одной из важнейших характеристик веществ,используемых в качестве сорбентов.
Измерения площади и объема пор образцов МОСFe(III) проводили методом низкотемпературной адсорбции азота на поромере ASAP2010N (Micrometrics, США). Расчет величины удельной поверхности методом БЭТпроизводили по результатам измерений в интервале относительных давлений P/P0 =0.0-1.0 с использованием БЭТ-уравнения для полимолекулярной адсорбции пара. Знаяудельную поверхность исследуемого порошка (Sуд), можно рассчитать средний диаметр частиц dср.
По результатам вычислений Sуд = 60 м2/г, dср составила 20 нм, чтосвидетельствует о наноразмерности сорбента.Исследование изотерм сорбции фосфорилированного белкаДля определения сорбционных свойств была построена изотерма сорбции казеина на МХС Fe(III) и МОС Fe(III). Концентрацию несорбированного белка измерялипо методу Бредфорд (рисунок 6).Рисунок 6 – Изотермы сорбции казеинана МХС Fe(III) и МОС Fe(III) при 19ºСВ интервале концентрацийдо 0.0025 мкмоль/мл, то есть в области, наиболее часто используемой в фосфопротеомном анализе,вид изотермы соответствует теории Ленгмюра.
Увеличение величины адсорбции при более высоких концентрациях может бытьсвязано с изменением ориентациимолекул адсорбируемого растворенного вещества или с образованием второго слоя.10На изотерме сорбции казеина на МОС Fe(III) видно, что на начальном участкесорбция удовлетворительно может быть описана уравнениями теории Ленгмюра. Адсорбция быстро достигает некоторой предельной величины при низкой концентрации, после чего увеличивается лишь незначительно (происходит насыщение), инаблюдается выход зависимости на плато.На основании построенных изотерм сорбции можно сделать вывод, что МХСFe(III) и МОС Fe(III) могут быть использованы в качестве сорбентов для выделенияфосфорилированных белков, так как при низких концентрациях аналита наблюдаетсяпрактически полная сорбция, и выход на плато насыщения наступает при достаточновысоких концентрациях белка в исходном образце.Термодинамические характеристики сорбции белкаДля расчета основных термодинамических функций процесса сорбции белкаказеина на МХС Fe(III) и МОС Fe(III) на изотермах сорбции, полученных ранее, быливыбраны четыре концентрации, при которых зависимость выходит на плато, что говорит об установлении равновесия.
Сорбцию проводили при добавлением к сорбентам выбранных концентраций белка при трех различных температурах (19°С, 29°С,39°С) (рисунок 7). Расчет констант адсорбционного процесса проводили по линеаризированному уравнению Ленгмюра и на основе полученных значений рассчитывалистандартные изменения энтальпии и энтропии процесса. Результаты представлены втаблице 1.АБРисунок 7 – Изотермы сорбции казеина при 19ºС, 29ºС, 39ºС: А – на МХС Fe(III), Б – на МОС Fe(III)СорбентТ, ºСКМХСFe(III)1929391929391160753608255740190822262911среднееΔH0,кДж/мольсреднееΔS0,Дж/моль·К-139 ± 2089 ± 15Таблица 1 – Значения величин К, ΔH0 иΔS0 при проведении сорбции казеина наМХС Fe(III) и МОС Fe(III) при 19ºС,29ºС, 39ºСУсредненные (n=3) значения стандартных изменений энтальпии ΔH0 и энтропии ΔS0 подМОС-83 ± 1657 ± 9твердили возможность протекаFe(III)ния процесса сорбции (таблица1).
Более того, как предел насыщения сорбентов (исходя из изотерм сорбции), так и значения термодинамическихпараметров сорбции указывают на различную чувствительность сорбентов по отношению к казеину: МХС Fe(III) имеет большую емкость в отношении казеина по сравнению с МОС Fe(III).Определение сорбционной емкости по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSIВажнейшей характеристикой сорбента является его сорбционная емкость, поскольку именно она определяет значимость сорбента для практического применения.В качестве аналита был выбран ранее исследованный фосфорилированный пептидSSNGHV(pY)EKLSSI. Пептид был взят с заведомым избытком, чтобы добитьсянасыщения сорбента. По его содержанию в проскоке, определенному методом11ВЭЖХ-УФ, рассчитывали сорбционную емкость, которая составила 0.035 ± 0.001мкмоль/мг для МХС Fe(III) и 0.019 ± 0.002 мкмоль/мг для МОС Fe(III), что значительно превышает емкость коммерческого сорбента PHOS-Select™ Iron Affinity Gel(Sigma Aldrich), содержащего железо(III), (до 0.0003 мкмоль/мг).Изучение специфичности сорбции пептидов, фосфорилированных по различным аминокислотамВ фосфорилированных пептидах остаток фосфорной кислоты может быть присоединен к трем аминокислотам: серину (S), тирозину (Y) и треонину (T), чаще всегок первым двум.
В связи с различием в их структурах, можно ожидать, что пептиды сразными сайтами фосфорилирования будут связываться с изучаемыми сорбентами вразличной степени. Были выбраны синтетические фосфорилированные пептидыSSNGHV(pY)EKLSSI (ранее исследованный при определении сорбционной емкостисорбентов) и FGE(pS)AGAAS (отличающиеся тем, к какой аминокислоте присоединен остаток фосфорной группы), а также его нефосфорилированный аналог FGESAGAAS. Все три пептида были взяты в равных количествах с заведомым избытком,чтобы по их содержанию в проскоке оценить долю связавшихся с сорбентом пептидов. Общее количество пептидов в 2 раза превышало нагрузку, выбранную при определении сорбционной емкости сорбентов, при том же количестве сорбентов.
Усредненные результаты (n=3) представлены в таблице 2.Сорбция относительно начальной нагрузки, %МХС Fe(III)МОС Fe(III)SSNGHV(pY)EKLSSI67 ± 261 ± 2FGE(pS)AGAAS52 ± 270 ± 2FGESAGAAS9±112 ± 1ПептидТаблица 2 – Содержаниесвязавшихся с сорбентомпептидовДействительно, к МХС Fe(III) и МОС Fe(III) исследуемые пептиды имеют различную специфичность: на МХС Fe(III) пептид, фосфорилированный по тирозину,сорбируется в более высокой степени, чем фосфорилированный по серину, а на МОСFe(III) ситуация обратная.
Нефосфорилированный пептид удерживается слабо в обоих случаях.АБРисунок 8 – Изотермы сорбции пептида SSNGHV(pY)EKLSSI при 19ºС, 29ºС и 39ºС: А – на МХСFe(III), Б – на МОС Fe(III)АБРисунок 9 – Изотермы сорбции пептида FGE(pS)AGAAS при 19ºС, 29ºС и 39ºС: А – на МХС Fe(III), Б– на МОС Fe(III)12Таблица 3 – Значения величин К, ΔH0 и ΔS0 при проведении сорбции пептидов на МХСFe(III) и МОС Fe(III) при 19ºС, 29ºС, 39ºСсреднеесреднееСорбентПептидТ, ºСКΔH0,ΔS0,кДж/моль Дж/моль·К19243SSNGHV(pY)EKLSSI29505-52 ± 251 ± 539955МХСFe(III)19114FGE(pS)AGAAS29125-6 ± 140 ± 13913519108SSNGHV(pY)EKLSSI29158-23 ± 442 ± 339202МОСFe(III)19197FGE(pS)AGAAS29325-30 ± 647 ± 339442Термодинамические расчеты (рисунки 8, 9, таблица 3), проведенные аналогично описанным выше, подтвердили выявленную специфичность сорбентов по отношению к пептидам, фосфорилированным по различным аминокислотам.Оптимизация условий металл-аффинной хроматографии фосфорилированных пептидовМетод металл-аффинной хроматографии позволяет в достаточно широких пределах варьировать условия проведения анализа, исходя из природы аналита и последующих стадий детектирования.
В случае фосфопротеомного подхода ключевым параметром успешности обогащения является степень извлечения фосфорилированныхпептидов из многокомпонентной смеси.Был исследован ряд элюентов для десорбции фосфорилированных пептидов cМХС Fe(III) на примере пептида SSNGHV(pY)EKLSSI.
Помимо классических растворителей для металл-аффинной хроматографии, были опробованы альтернативныеподходы, а именно (таблица 4): замещение аналита растворителем родственнойструктуры (фосфорная кислота); добавление вещества, образующего очень устойчивые комплексы с железом (роданид натрия, трилон Б), способного вытеснить аналитза счет комплексообразования; добавление вещества, которое может вытеснить аналит с сорбента за счет более сильного связывания (перфтороктановая сульфокислота(ПФОС), перфторгексановая кислота, додецилсульфат натрия (ДСН)).Элюент0.4M NH4OH15% ПФОС в 0.4M NH4OH5% NaSCN в 0.4M NH4OH10% трилон Б в 0.4M NH4OH0.5% H3PO40.5% пиперидин15% ПФОС в 0.5% пиперидине10% н-C6F12COOH в 0.5% пиперидине0.05% ДСН в 0.5% пиперидине0.0005% H3PO4 в 0.5% пиперидинеСтепень извлечения, %40 ± 159 ± 345 ± 244 ± 344 ± 263 ± 386 ± 310 ± 113 ± 212 ± 2Таблица 4 – Степени извлеченияпептида SSNGHV(pY)EKLSSI сМХС Fe(III) различными элюентамиАнализ элюатов былпроведен методом ВЭЖХУФ (таблица 4).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
