Диссертация (1150323), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Схема трансформации мочевины выглядитследующим образом:CO(NH2)2 + уреаза→ 2 NH4+36Пробу, содержащую мочевину, смешивают с раствором реагента ивыдерживают в течение 15 минут при 37 ºС. После чего измеряют поглощениепри 550 нм относительно холостой пробы. Стандартное отклонение по даннойметодике составило 3 %, а предел обнаружения – 2 ммоль/л. Недостатком даннойметодики перед другими ферментативными является использование большогоколичества реактивов.Автором статьи [115] была предложена методика флуориметрическогоопределения мочевины в моче. Методика основывается на взаимодействиимочевины с диацетилмонооксимом в кислой среде.
Получаемый по реакциипродукт флуоресцирует при 410 и 525 нм.CH3CH3COCNOH+ H2OCH3OCГидроксиламинCH3H2NOCNOCNO+CCCH3МочевинаC+ HONH2ДиацетилCH3H2NOCH3ДиацетилмонооксимCCДиацетилO + H2OCH3ДиазинАнализ проводится следующим образом. К пробе, содержащей раствормочевины, добавляют растворы серной кислоты и диацетилмонооксима. Смесьтермостатируют на водяной бане в течение 40 минут, после чего проводятфлуориметрическое определение аналита относительно дистиллированной воды.37Флуоресценция при 525 нм наблюдается только при избытке реагента, афлуоресценция при 410 нм дает пропорциональные результаты только принебольшом содержание мочевины.
Предел обнаружения данной методикипорядканесколькихнмоль,чтоделаетданнуюметодикудостаточночувствительной. Авторы также установили, что интенсивность флуоресценциизависит от температуры. С увеличением температуры скорость образованияпродуктов при 525 нм заметно возрастает. Рекомендованной температурой дляпроведения реакции является 100 ºС и время 40 минут. Мешающее влияниеоказывают соединения типа RNHCO(S)NR’R”, где R – водород или простойалифатический радикал, R’ – водород, простой алифатический радикал илифенильная группа, а R” – менее сложный радикал, чем фенильная группа.Основной недостаток этой методики — светочувствительность комплекса ибыстрое снижение интенсивности флуоресценции, что частично устраняетсявведением в реакцию тиосемикарбазида и ионов железа [116].
Другимнедостатком является токсичность реактивов, используемых для проведенияданной реакции.Авторами [117] было проведено сравнение методик фотометрическогоопределения карбамида в морской воде, предложенных в [118] и [119]. В основахработ использовалась реакция карбамида с диацетилмонооксимом в кислой средев присутствие хлорида железа (III) и тиосемикарбазида. Авторами [118] былопредложено проводить эту фотометрическую реакцию при 85 ºС в течение 20минут, охлаждать 5 мин и измерять оптическую плотность при 520 нм.
Былоотмечено, что для обеспечения воспроизводимости результатов необходимострого соблюдать время нагревания и охлаждения. Однако авторы [119] внеслисвои изменения, проводя фотометрическую реакцию при комнатной температуре,в темном помещении в течение трех дней. Максимальное значение оптическойплотности наблюдалось примерно через 72 часа и оставалось постоянным еще втечение 48 часов при температуре 22 ºС. В этом случае не требуется строгоесоблюдение условий проведения реакции. Сравнивая результаты определениякарбамида при комнатной температуре (72 часа) и при температуре 85 ºС (25 мин)38авторы не получили значительных расхождений, значения стандартногоотклонения составили 1,6 % и 2,0 % соответственно, что говорит о хорошейвоспроизводимости обеих методик. Недостаток методик – длительное времяпроведения анализа, что ограничивает возможности использования метода.Известнобольшоеколичествопубликаций,посвященныхпрямомуспектрофотометрическому определению карбамида с использованием реактиваЭрлиха (п-диметиламинобензальдегида) [120 – 124].
Так, авторами [125]предложена методика, основанная на взаимодействии мочевины цельной крови среактивом Эрлиха в кислой среде. Отфильтрованный раствор пробы смешивают среагентом и разбавляют дистиллированной водой. Через 10 минут измеряютоптическую плотность на спектрофотометре при 420 нм относительно холостойпробы. Также авторами было показано, что для увеличения точности определениямочевины измерение оптической плотности следует проводить при 435 нм.
Приэтом анализ можно проводить, не используя холостую пробу, так как реагент непоглощает свет при заданной длине волны. Предел обнаружения методики – 2мг/л. Мешающее влияние оказывают амины, амиды и сульфаниламиды.Достоинствами данной методики являются экспрессность, высокая точность,отсутствие в необходимости применения дорогостоящего оборудования.Применение жидкостной хроматографии (ЖХ), особенно в варианте еёвысокого разрешения (ЖХВР) представляет особый интерес в целях определениямочевинывбиологическихжидкостях,фармацевтическихпрепаратахикосметической продукции [126 – 130]. Однако, как отмечают авторы [131],широкого практического применения разработанные методики не нашли в связисо сложностью выполнения эксперимента, а в некоторых случаях недостаточнойчувствительностью.Авторами[132]быларазработанаЖХВРметодикаопределения карбамида в алкогольных напитках с более простой и быстройручной процедурой дериватизации.
Для этого пробу разбавляли этиловымспиртом, и смешивали с ксантгидролом (Рисунок 7 А), растворенным впропиловом спирте, и добавляли соляную кислоту для создания кислой среды, вкоторой протекала реакция образования ксантилмочевины (Рисунок 7 Б) и39диксантилмочевины (Рисунок 7 В) в течении 5 мин. Выбранные условияпозволили избежать образовании осадка, о котором сообщалось в более раннихработах [133, 134], таким образом, после дериватизации раствор напрямуюинжектировался в колонку хроматографа с флуоресцентным детектором(возбуждение при 233 нм, эмиссия при 600 нм).OOHHNNH2ONNHOOАБOOHВРисунок 7. Структурные формулы ксантгидрола (А), ксантилмочевины (Б),диксантилмочевины (В).Взяв за основу предложенный способ дериватизации, авторы [131]предложили свой вариант ЖХВР с флуориметрическим типом детектированиядля определения карбамида в винах и моче.
В работе были пересмотреныоптимальные длины волн возбуждения и излучения и выбраны 213 и 308 нм,соответственно. Кроме того, авторы объяснили причину отсутствия осадка впроцессе дериватизации преобладанием продукта реакции ксантилмочевины,проведя для этого масс-спектрометрический анализ полученного дериватизата.Разработанная методика обладает высокой чувствительностью (ПО = 0,003 мг/л) иэкспрессностью (время удерживания – 2 мин). Процедура пробоподготовки(дериватизации) была осуществлена в автоматизированном режиме ЖХВР(autosampler), что привело к снижению расхода пробы и трудозатрат, а такжеповысило воспроизводимость результатов. Единственным недостатком методикиявляется использование дорогостоящей аппаратуры.Для определения карбамида в жидкостях используются те же проточныеметоды, что и для определения ионов аммония с различными способамидетектирования: спектрофотометрическим [111, 135, 136], электрохимическим40[111, 137], флуориметрическим [138], и хемолюминесцентным [139, 140].Проточные методы анализа также можно классифицировать на методы прямого икосвенного анализа [108].
Как уже отмечалось, отличие косвенных методованализа от прямых заключается в предварительном разложении мочевины до CO2и NH3 уреазным методом, путем добавления в поток пробы раствора ферментауреазы. Таким образом, определение карбамида осложнено дополнительнойстадией его гидролиза, что снижает производительность проточного анализа.На том же принципе разложения карбамида до аммиака основанавтоматический электрохимический чип [141].
Чип имеет размер 20 × 15 мм ивключает следующие компоненты (Рисунок 8): смесительный канал, разделенныйна два проточных канала; инжекционный и смесительный клапаны, основанныена эффекте электросмачивания; линия задержки для регулирования времениперемешивания; pH регулятор и датчик аммиака. Когда стандартный растворкарбамида заполняет проточный канал 1 (Рисунок 9 А), смесительный клапаноткрывается и по проточному каналу 2 подается раствор уреазы (Рисунок 9 Б),заполняя вторую половину смесительного канала. Время, необходимое длясмешивания растворов (Рисунок 9 В), определяется линией задержки, котораясвязана с электродом (1) смесительного клапана (Рисунок 9 Г) и составляетпримерно 200 с. По истечении необходимого времени для перемешиванияинжекционный клапан в конце смесительной канала автоматически открывается ираствор попадает в отдел pH регулятора (2) (Рисунок 9 Д и Е), где pH доводитсядо необходимого значения 12 автоматически.
После этого выделенный аммиакрегистрируется с помощью датчика – хлорсеребряного электрода. Определениеконцентрации карбамида производится путем пересчета разницы потенциаловpH-индикаторного электрода с момента ввода растворов карбамида и уреазы домомента определения аммиака.
Линейная зависимость между потенциалом илогарифмом концентрации карбамида наблюдалась в широком диапазонеконцентраций. Отсутствие программного обеспечения и миниатюризация анализаделают этот подход привлекательным. Однако недостатками такой системы41являются сложность изготовления чипа и использование массива электродов, чтоделает анализ дорогостоящим.Рисунок 8. Электрохимический чип для определения карбамида.Рисунок 9. Схема анализа определения карбамида с помощью автоматическогоэлектрохимического чипа.1.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
