Диссертация (1145917), страница 15
Текст из файла (страница 15)
truncatula (линия 2HA) навегетативной стадии развития (данную пробу использовали в качестве контроля),79который мы приняли равным единице. Гены MtPIN2, 3, 5 и 7 продемонстрировалиболее низкий уровень экспрессии в семязачатках по сравнению с уровнемэкспрессии во взрослом растении. У двух генов (MtPIN1 и 4) различие междудвумя пробами было выражено незначительно.
У одного гена – MtPIN10(SMOOTH LEAF MARGIN1) – уровень экспрессии в семязачатках был значительновыше (Таблица 4).Известно, что у A. thaliana транспортёры PIN, регулирующие формированиеэмбриона и прилежащих тканей, также функционируют и в вегетативных частяхрастения (Křeček et al., 2009), поэтому можно предположить, что у M. truncatula вразвитии семязачатка могут участвовать гены PIN, которые экспрессируются нетолько в этом органе. Поэтому, помимо сравнительного анализа экспрессиикаждого гена PIN в разных органах растения, мы также сравнили уровниэкспрессии разных генов PIN друг относительно друга.
Для этого мыпроанализировали данные, представленные в атласе экспрессии генов люцерны –Medicago truncatula Gene Expression Atlas (http://mtgea.noble.org/v3/). В этом атласенет информации об уровнях экспрессии генов в семязачатках, но представленыданные об экспрессии в плодах M. truncatula. Согласно этим данным,максимальный уровень экспрессии в плодах M. truncatula демонстрируют геныMtPIN1, MtPIN4 и MtPIN10 (Таблица 4), при этом для MtPIN4 уровень экспрессиив плодах повышен посравнениюс уровнями в большинстведругихисследованных органов (Benedito et al., 2008).Таблица 4. Уровни экспрессии генов PIN M. truncatula в плодах и всемязачатках.
Для данных ПЦР-РВ указаны значения по сравнению с уровнемэкспрессии в целом растении (принят равным единице). Приведено среднее издвух биологических повторностей, указаны стандартные отклонения. Для данныхMedicago truncatula Gene Expression Atlas указаны относительные единицыэкспрессии.80Уровень экспрессии Уровеньвэкспрессиивплодах,семязачатках, данные M. truncatula Gene Expressionданные ПЦР-РВ.Atlas (в скобках указан номер гена вбазе данных).MtPIN10,482±0,274426,24 (Mtr.38716.1.S1_at)MtPIN20,023±0,02911,63 (Mtr.45124.1.S1_at)MtPIN30,010±0,00488,81 (Mtr.45439.1.S1_at)MtPIN40,813±0,3791525,37 (Mtr.1076.1.S1_at)MtPIN50,262±0,1619,44 (Mtr.17296.1.S1_at)MtPIN70,123±0,1317,19 (Mtr.3196.1.S1_at)MtPIN10 (SLM1)5,698±1,770125,88 (Mtr.47942.1.S1_at)Согласно филогенетическому древу генов PIN M.
truncatula и A. thaliana(Zhou et al., 2011b), гены M. truncatula MtPIN1, MtPIN4 и MtPIN10 (SLM1)являются одними из самых близких гомологов генов PIN1, PIN4 и PIN7,работающих в ЗЭ у A. thaliana.Таким образом, исходя из вышеизложенных данных, мы заключили, чтоуровень транскрипции генов MtPIN1, MtPIN4 и MtPIN10 (SLM1) повышен всемязачатках и, предположительно, эти гены являются участниками ЗЭ у M.truncatula.Далее мы измерили уровни экспрессии генов длинных MtPIN в ходе СЭ.Данный эксперимент проводили с эмбриогенной линией 2HA и неэмбриогеннойлиниейA17.Листовыеэксплантыкультивировали натвёрдой средесконцентрацией НУК 10 мкМ и БАП 4 мкМ в течение трёх недель — в это времяформировались каллусы. С четвёртой по шестую недели полученные каллусыкультивировали на среде без гормонов.Согласно литературным данным, соматические эмбрионы становятсявидимыми на эмбриогенных каллусах линии 2HA после 28 дней культивированияна среде с гормонами (Chen, 2009).
Сходным образом, в наших экспериментах втечение 4ой-6ой недель культивирования на каллусах эмбриогенной линии 2HA81мы наблюдали формирование соматических эмбрионов, при этом количествоэмбрионов росло с увеличением срока культивирования. На каллусах линии A17эмбрионы не формировались.Итак, мы сравнили динамику изменения уровней экспрессии генов MtPIN1,4и 10 у эмбриогенной и неэмбриогенной линий в условиях, способствующихпоявлению соматических эмбрионов. Для генов MtPIN1 и MtPIN4 мы не выявилидостоверных различий, связанных с формированием соматических эмбрионов(Рисунок 3, а, б). Известно, однако, что функционирование генов PIN можетрегулироваться множеством способов; в частности, крайне важным являетсярасположение транспортёров PIN в клетке, которое определяет направлениетранспорта ауксина.
Таким образом, нельзя исключить возможность того, чтогены MtPIN1 и MtPIN4 участвуют в СЭ, но их активация осуществляется не засчёт повышения уровня транскрипции, а за счёт каких-либо других механизмов(например, изменение места экспрессии или изменение локализации белков намембране). Локализация белков PIN в эмбриогенных каллусах, а также анализмутантов по этим генам помогут подтвердить или опровергнуть эту гипотезу.Ген MtPIN10 (SLM1) продемонстрировал повышенный уровень экспрессии унеэмбриогенной линии A17 по сравнению с линией 2HA в ходе формированиякаллуса (1-3 недели), однако на более поздних сроках (6 недель), которыесоответствуют развитию соматических эмбрионов, было отмечено достоверноеувеличение уровня транскрипции этого гена у эмбриогенной линии по сравнениюс линией A17 (Рисунок 3, в).В ранее проведённых исследованиях уже было обнаружено большоеколичество функций гена MtPIN10 (SLM1); в частности, мутанты slm1 у M.truncatula характеризуются множественными нарушениями развития (гладкаякромка листа, нарушения архитектуры побега и соцветия, нарушения развитиясложных и простых листьев, а также цветков) (Zhou et al., 2011a; Peng, Chen,2011).
SLM1 является близким гомологом гена A. thaliana PIN1 (Zhou et al., 2011а),однако, согласно одной из последних работ, SLM1 входит в состав другой ветвигенов PIN (O'Connor et al., 2014). Эта ветвь (её назвали Sister-of-PIN1) отсутствует82у крестоцветных, поэтому в предыдущих филогенетических исследованиях,основанных на генах PIN у A.
thaliana, её объединяли с ветвью PIN1.У A. thaliana именно PIN1 обеспечивает создание ауксиновых максимумовпри СЭ и является необходимым для развития соматических эмбрионов (Su et al.,2009). Однако, у других видов, в геноме которых присутствует ветвь Sister ofPIN1, функции, аналогичные функциям PIN1 A. thaliana, могут быть разделенымежду гомологами PIN1 и гомологами Sister of PIN1. В связи с этим, представляетинтерес локализация белков M. truncatula SLM1 (член ветви Sister of PIN1), атакже MtPIN4 и MtPIN5 (члены ветви PIN1) в СЭ.Таким же образом мы проанализировали экспрессию тех генов MtPIN, длякоторых не был выявлен повышенный уровень транскрипции в семязачатках:MtPIN2,3,5 и 7.
Мы не выявили значительного повышения уровня экспрессииMtPIN2,3 и 5 в ходе СЭ (Рисунок 3, г-е). Экспрессию MtPIN7 в данных условияхнам не удалось детектировать (данные не представлены).83Рисунок 3. Изменение относительных уровней экспрессии генов MtPIN1 (а),MtPIN4 (б), MtPIN10 (SLM1)(в), MtPIN2 (г), MtPIN3 (д), MtPIN5 (е) в условиях,способствующих СЭ, у эмбриогенной линии 2HA и неэмбриогенной линии A17(0,1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель). Для генов MtPIN1,4 и 10 эксперимент проводился в трёхбиологических повторностях. Для генов MtPIN2,3 и 5 эксперимент проводился вдвухбиологическихдоверительныеповторностях.интервалы,ПланкирассчитанныеСтьюдента для уровня значимости 0,05.напогрешностейоснованииуказываютt-распределения843.1.2.КоличественныйанализэкспрессиигеновWOXMedicago truncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезеАналогичные эксперименты были проведены и для генов WOX.
У M.truncatula известно 12 генов WOX (Chen et al., 2009), и к настоящему моментуисследовано участие трёх из них в СЭ. MtWUSCHEL (MTR_5g021930) и MtWOX9like (MTR_7g026130) являются важными участниками СЭ и экспрессируются вкаллусах и в образующихся соматических эмбрионах (Chen et al., 2009, Kurdyukovet al., 2014). MtWOX5 (MTR_5g081990) также активируется в соматическихэмбрионах, и его экспрессия в основном ассоциирована с регенерацией корней(Chen et al., 2009).Мы выбрали для исследования по два гена WOX из каждой эволюционнойветви семейства WOX: MTR_1g115315 и MTR_3g115620 (древняя ветвь),MTR_7g086940 (MtWOX11-like) и MTR_2g015000 (MtWOX9-1) (промежуточнаяветвь), а также MTR_1g019130 (MtWOX4-like) и MTR_8g107210 (STENOFOLIA,или STF) (ветвь WUS).
Ранее их роль в СЭ не была изучена. Как и для генов PIN, cпомощью ПЦР-РВ мы сравнили уровень экспрессии генов MtWOX в семязачаткахс их уровнем экспрессии во взрослом растении M. truncatula на вегетативнойстадии развития.У трёх генов WOX (MtWOX4-like, MTR_1g115315, MTR_3g115620) уровеньэкспрессии в семязачатках был ниже такового во взрослом растении. У генаMtWOX11-like различия между двумя этими пробами были небольшими, и,наконец, у двух генов – STF и MtWOX9-1 – уровень экспрессии в семязачаткахбыл значительно выше (Таблица 5).85Таблица 5.
Уровни экспрессии генов WOX M. truncatula в семязачатках. Дляданных ПЦР-РВ указаны значения по сравнению с уровнем экспрессии в целомрастении (принят равным единице). Приведено среднее из двух биологическихповторностей, указаны стандартные отклонения.Уровень экспрессиивсемязачатках,данные ПЦР-РВMtWOX4-like0,099±0,072MtWOX9-171,335±59,316STF11,714±1,646MtWOX11-like0,988±0,105MTR_1g1153150,224±0,113TA32763_38800,076±0,046Согласно построенному ранее филогенетическому древу генов WOX A.thaliana и M. truncatula (Chen et al., 2009), ген MtWOX9-1 эволюционно близок кгену WOX9 A. thaliana, поэтому можно предположить, что он участвует в ЗЭ.Кроме того, в предыдущих исследованиях было показано, что MtWOX11-like и STFэкспрессируются в семязачатках (Kurdyukov et al., 2014, Tadege et al., 2011), чтосогласуется с нашими данными. На основании вышеизложенного мы заключили,что в семязачатках повышается уровень транскрипции генов MtWOX11-like, STF иMtWOX9-1.Как и для генов PIN, далее мы проверили уровни экспрессии этих геновWOX в условиях, способствующих развитию соматических эмбрионов.
Уровеньэкспрессии гена MtWOX9-1 в ходе СЭ значительно повышался (Рисунок 4, а). Этотген является одним из гомологов гена WOX9 A. thaliana. WOX9 – это известныйрегулятор эмбриогенеза, согласно последним данным, он напрямую стимулируетделение клеток через активацию транскрипции гена циклина CYCP2;1 (Peng et al.,2014). Наши данные позволяют предположить, что его гомолог у люцерны важендля развития соматических эмбрионов.86Гены STF и MtWOX11-like такжеувеличениеуровняэкспрессиинапродемонстрировали достоверноестадиях,соответствующихразвитиюсоматических эмбрионов, у эмбриогенной линии (Рисунок 4, б, в).Гену STF M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
