Диссертация (1145917), страница 14

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 14)

Праймеры, использованные в работе (Бигль, Россия).Праймеры для ПЦР-РВНазвание ГенПоследовательностьпарыпраймеровUbi-rltУбиквитинF: ATGCAGATYCTTGTGAAGAC(XM_003627103/MTR_8R: ACCACCCCGRAGACGGAGg018230)Act-rltАктинF: CAATGTGCCTGCCATGTATGT(XM_003602497/MTR_3R: ACTCACACCGTCACCAg095530)MtSERKMedtr1g097160/XM_013F: AGCGTCCTCCACATCAAGAA1-rlt614105R: CAATCCAAAATCCCCCACAA/Mtr.43625.1.S1_at/MtSERK1712g01-rltMedtr2g015000/XM_003F: CCAGAACAAGAATCAGAACCAGAAC593638R: TTAGGGAAACCAAGGGAAAATAC/Mtr.5935.1.S1_at7g10-rltMtWOX11-F: TCACTCTGGATTTGGAGGTGCTlike/Medtr7g086940/XM_ R: TTCATTTGTGGGAACTGGCA003624692/Mtr.28819.1.S1_at1g02-rltMtWOX4-F: CGTGGATTTTGGGAGCATGAlike/MTR_1g019130/XMR: GGGAGCAGTTTCGGGTCTAA_0035891104g15-rltBt-rltTa-rltSTENOFOLIA/MTR_8g1F: CCACCACAACCACAGTAACAAC07210/XM_003631059R: GCATCCATGATCTCCATTCCBT146874/MTR_1g1153F: GGTGGAAAAATGGAAGTATCTGG15R: ACACGAACATAAGCCCAAGCAMTR_3g115620F: TCATCGGGTCAAGGATATGTACR: ACTTCATTAGTGGTTCATCAACATTMtPIN10MtPIN10/SMOOTHF: AGTTCAAGTGCTTCACCTGTTTCTGAA-rltLEAFR: ATCAATTTCCTCCACACCATAATCAAAMARGIN/Medtr7g089360/AY553212/Mtr.47942.1.S1_atMtPIN1-MtPIN1/AY115836rltMtPIN2-R: CCACTTTCCCTACCTCTTCTTCTACCMtPIN2/AY115837rltMtPIN3-F: ATGGGCGGTGGAAGTGGTAAR: GCTGGTGGCATCTGTGTATTTTTGMtPIN3/AY115838rltMtPIN4-F: ATGGCTCTGCTGCTGCTGCTAAF: CGCAAACCGTGCCTACTTCR: TCCTCTTCCCCACCTATTTCCMtPIN4/AY115839F: CAAAAACTATCCTGCACCTAATCCA72rltMtPIN5-R: ATCTCCACCTTTCTCACCTCCTTCAMtPIN5/AY115840rltMtPIN7-F: GAACACCACCGAGGACTTGTAATR: CATCGTTTTTGCCCCACCTTMtPIN7/AY553210rltF: GAAAGGGGCAACACCTCAGTAR: GTCTCTTTCTCTTCGACTATCACTCAMtCUC-Medtr2g078700/XM_013F: TCAACAGCAACAGCAATGGAArlt609196R: GCCGAGGAGAAAAAGAAAGGAMtLEC1Medtr1g039040/XM_003F: GCTTTGCCTCCTTCTTTTCCAA-rlt589718R: GAGCAGCATCATCACCACCAMtSCR-Medtr7g074650/XM_003F: CAACAACACCACCACCACCArlt623651R: GTCCCGAAAGGCGTAGAAAG/Mtr.39371.1.S1_atMtSHR-Medtr4g097080/XM_003F: CCAACAAGAAGAAGACGAAGAATGrlt608480R: ATCAGTTGTGGTGGGGGTGT/Mtr.47195.1.S1_atMtBBM-Medtr7g080460/XM_003F: CAACCAACAAGCACAACCAAArlt624164R: CTACCATCACCACCGCCACA/Mtr.21627.1.S1_atMtMP-rlt Medtr1g024025/XM_013610718F: TTCAACCCCCAACTCAAGAAR: GCCGACAAACAAACTCCAACC/Mtr.39035.1.S1_atMtAS2-MtAS2/Medtr8g040900/X F: TGGAATTGGGAGCAACTATGrltM_013589654R: TATTACCTATAGCATTAGAAACCCTABAr-Medtr7g070050/XM_003F: TCCGTGAAGTCCGTGTCATCT45080-rlt623318R: GGAGAAGGGTGGAGAGTGGTG/Mtr.45080.1.S1_atMtGAST- Medtr1g025250/BT14466 F: AAGTATGGTGGCAGAAGCAAGAAlike-rlt7/Mtr.35796.1.S1_atR: CAAGATGAAGAAGGAGGAGTGATG73MtGH3.6 Medtr5g016320/XM_003F: TTGAACAAAACGCAGAAACTGAAT-rltR: TGGATGAGCAGACAAGATAGGAGA611605/Mtr.40263.1.S1_at/MtGH3.6MtERF6- Medtr4g078710/XM_003F: GCCCAAAAGCCAAAACCAACrltR: GCACCATTCCATCAACAGCA607448/Mtr.26158.1.S1_atMtERF11 Medtr2g014300/XM_003F: GCCGCTCGTTCTCTTCGTG-rltR: GTGGAGGTGGAGGAGGGTTG593578/Mtr.985.1.S1_atMtHB1MtHB1/Medtr8g026960/F: AGGCTGAGGTGAAACCAAGTCCXM_003627463/Mtr.1876 R: AGCACTCCAATCTTCTGGTGATGT9.1.S1_atABAhx_Medtr1g019410/XM_003F: TTGGGGTGACGATGGATGC244180-589135R: GCTCTTCCCTCAACCTCGGCrlt/Mtr.24418.1.S1_atAHP-Medtr1g082290/XM_003F: GCCTGCATTTCCTTCCGTGAlike-rlt591002R: CAAAAGCTCCTCCTCCATCTTGA/Mtr.11553.1.S1_atABAhx_Medtr4g086130/XM_003F: ATTTAGGTGGGAGGTAGTGGGATA42075-rlt607927R: ATGTTGGGGTGGCAAGGAA/Mtr.42075.1.S1_atSAUR83- Medtr3g084250/XM_003F: GGTGGTCTTACAATTCCGTGCrltR: ACAACTAGTCAATCCTACTGTGCGA601629/Mtr.14486.1.S1_atSAUR70- Medtr4g072890/Mtr.697.F: AATTCCTAAATCTTACTTCTCGCTTGAlike--rltR: GAATGATTGATTAATACATGGACGGA1.S1_atSAUR69- Medtr4g072230/XM_003F: ACATCTCGCTCGAATGGGCTrltR: CACTTTTTCCCATCTTTACAATTTCA60705174/Mtr.49767.1.S1_x_atSAUR29- Medtr8g076040/XM_003F: AGAGCTGAGGAGGAATTTGGCTrltR: GATCGAAATTGCAAAGACCTAGAAA629290/Mtr.49400.1.S1_atПраймеры для создания конструкцийНазваниеЦель использованияПоследовательностьКлонирование промотора генаF:AAAGCGGCCGCCCTGTCTGAAMtWOX9-1 в вектор p369entry-TGAGGATGAAAAclone по сайтам рестрикцииR:AAAGGCGCGCCGATGATGATGNotI/AscIAAGAATCACTGATGAКлонирование промотора генаF:ATGGCGGCCGCTGGCTTGGAGпарыпраймеровp2g01entrp4g15entrSTF в вектор p369entry-clone по TGTGATTGCTTCсайтам рестрикции NotI/AscIR:ACCGGCGCGCCGTTGTCAACTAGGGCTTTTCTCACTAAAp7g10entrКлонирование промотора генаF:CATGCGGCCGCGCTCCAAACTMtWOX11-like в векторCCCAAACAAAp369entry-clone по сайтамR:TTAGGCGCGCCTCCAATGCACрестрикции NotI/AscITATAGATAGAAGAAATAMtPIN10_5' Клонирование части гена SLM1 F:GGGGACAACTTTGTATAGAAAи его 5’-регуляторнойAGTTGGATTTGGGCTAGTAATGGобластигена SLM1 в векторCTTpDONR P4-P1rR:GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGAAAAAATCTCACTTCTTGAACTAGTTGMtPIN10_3' Клонирование части гена SLM1 F:GGGGACAGCTTTCTTGTACAAи его 3’-регуляторной области в AGTGGGTTCTAGAAGGTCTCAT75вектор pDONR P2r-P3GGTGTTAACTR:GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGAGGTTGTTTATTGTTGACGACACMtBBM1cdКлонирование кодирующейF:GGGGACAAGTTTGTACAAAAsпоследовательности генаAAGCAGGCTTCATGGCCTCTATMtBBM1/XM_003624164/Medtr7 GAACTTGTTAGGTTTg080460 в вектор pGADT7 поR:GGGGACCACTTTGTACAAGAсайтам attP1 и attP2.AAGCTGGGTCCTATTCATGCAACAAAGTGAAAGGAMtBBM3cdКлонирование кодирующейF:GGGGACAAGTTTGTACAAAAsпоследовательности генаAAGCAGGCTTCATGAACAATAAMtBBM3/XM_003606710/Medtr4 CTGGCTTTCATTCg065370 в вектор pGADT7 поR:GGGGACCACTTTGTACAAGAсайтам attP1 и attP2.AAGCTGGGTCCTAATTCTCTCTTGTCTCATAGTCATTCMtAGL15A Клонирование кодирующейcdsMtSHRcdsF:GGGGACAAGTTTGTACAAAAпоследовательности генаAAGCAGGCTTCATGGGGAGGGGMtAGL15A/XM_013602562/MeAAGAGTGCAdtr4g109830R:GGGGACCACTTTGTACAAGAв вектор pGADT7 по сайтамAAGCTGGGTCCTATTCATTTATAattP1 и attP2.GGACGAATCATCCКлонирование кодирующейF:GGGACAAGTTTGTACAAAAAпоследовательности генаAGCAGGCTTCATGGATACGCTGMtSHR/XM_003608480/Medtr4TTTAGGCTTGg097080 в вектор pGADT7 поR:GGGGACCACTTTGTACAAGAсайтам attP1 и attP2.AAGCTGGGTCTCAAGGCCTCCATACACTGG76MtLEC1AcКлонирование кодирующейF:GGACAAGTTTGTACAAAAAAdsпоследовательности генаGCAGGCTTCATGGCTGGAATAAMtLEC1A/XM_003589718/Medtr GGGAACAA1g039040 в вектор pGADT7 поR:GGGACCACTTTGTACAAGAAсайтам attP1 и attP2.AGCTGGGTCTCACATATTATTATTATGATTATCACGTTTMtMINI3cd Клонирование кодирующейsMtFUS3cdsF:GGGGACAAGTTTGTACAAAAпоследовательности генаAAGCAGGCTTCATGGCTGGGATMtMINI3/XM_013603380/TGACGAAAATMedtr3g009470R:GGGGACCACTTTGTACAAGAв вектор pGADT7 по сайтамAAGCTGGGTCTTACATGTGAGGattP1 и attP2.TCCAAGAGGCКлонирование кодирующейF:GGGGACAAGTTTGTACAAAAпоследовательности генаAAGCAGGCTTCATGGAGTGTGGMtFUS3/XM_013593352/Medtr7TTTAGATCTGCAg059330 в вектор pGADT7 поR:GGGGACCACTTTGTACAAGAсайтам attP1 и attP2.AAGCTGGGTCTCATTTTTTTCTCTTTGGTGAAGATПраймеры для генотипирования растенийLTR6Генотипирование растений изGCTACCAACCAAACCAAGTCAAлинии NF8274, праймер квставке Tnt1.LTR6JГенотипирование растений изACAGTGCTACCTCCTCTGGATGлинии NF7292, праймер квставке Tnt1.8274Генотипирование растений изF:TATCCGACGCCCAAACAAACлинии NF8274, проверкаR:TTCATTTGTGGGAACTGGCAналичия вставки Tnt1 в генеMtWOX11-like и77гомозиготности растений поданной вставке.7292Генотипирование растений изF: GAGCAGCATCATCACCACCAлинии NF7292, проверкаR:наличия вставки Tnt1 в генеGGCTGGAATAAGGGAACAAGAMtLEC1A и гомозиготностиCCрастений по данной вставкеВизуализация экспрессии генов.

Детекцию активности репортерного генаGUS осуществляли c помощью субстрата X-Gluc (Thermo Scientific), инкубируярастительные ткани в буфере для GUS-окрашивания (100 mM Tris-Cl (pH 9.5); 100mM NaCl; 0,5 мМ K3Fe(CN)6; 0,5 мМ K4Fe(CN)6; 0,5 мМ X-Gluc, предварительнорастворённый в диметилсульфоксиде) при 37°C в течение 1,5-12 часов. Далеекаллусы обесцвечивали, погружая в 70% этанол, или фотографировалинепосредственно после GUS-окрашивания. Фотографии каллусов получены спомощью стереомикроскопаSteREOLumar V12(Carl Zeiss, Германия),снабжённого цифровой камерой MRc5 (Carl Zeiss, Германия) или с помощьюстереомикроскопа M205C (Leica, Германия), снабжённого цифровой камеройDFC420 (Leica, Германия).Статистические методы и компьютерные программы, используемые вработе. Для работы с последовательностями ДНК использовали программы VectorNTI Advance 10 (Thermo Scientific) и ApE (M.

Wayne Davis). Для оценки доливидимойповерхностикаллуса,покрытойсоматическимиэмбрионами,использовали программу ImageJ (Schneider et al., 2012).Достоверность различий в уровнях экспрессии оценивали с помощью tкритерия Стьюдента. Достоверность различий в процентах площади каллуса,покрытой соматическими эмбрионами, оценивали с помощью критерия МаннаУитни.783.

Результатыи обсуждение3.1. Выявление генов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходесоматического эмбриогенеза3.1.1. Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезеМы решили начать поиск новых регуляторов СЭ среди генов PIN,участвующих в ранних этапах ЗЭ, а также в развитии тканей, окружающихэмбрион. Исходя из этого, первой поставленной задачей было выявление геновPIN, которые могут участвовать в развитии семязачатков и в ЗЭ у M. truncatula.У M. truncatula выделено всего 10 генов PIN (MtPIN1-MtPIN10), семь изкоторых (MtPIN1-5, MtPIN7 и MtPIN10, или SMOOTH LEAF MARGIN 1(SLM1))принадлежат к группе длинных PIN, т.е., по-видимому, кодируют транспортёры,которые локализованы на плазмалемме и обеспечивают межклеточный транспортауксина.

Оставшиеся три белка (продукты генов MtPIN6, MtPIN8 и MtPIN9)предположительно локализуются на мембране ЭПС (Křeček et al., 2009, Zhou et al.,2011b). С помощью ПЦР-РВ мы провели первичный анализ уровней экспрессиигенов длинных PIN для того, чтобы выявить предполагаемых участниковэмбриогенеза. Мы измерили уровни экспрессии этих генов в семязачатках M.truncatula (линия 2HA) возрастом от нуля до трёх дней после опыления (в этовремя эмбрион проходит самые ранние стадии развития, от зиготы до глобулярнойстадии (Kurdyukov et al., 2014)).

Измерение уровня экспрессии в семязачаткахвыявляет гены, транскрипция которых происходит не только в клетках эмбриона,но и в клетках окружающих его тканей. Мы предполагаем, что эти же гены могутработать в клетках, окружающих эмбриогенные клетки в каллусе в ходе развитиясоматических эмбрионов, поэтому их выявление также представляет интерес.Для выявления тех генов PIN, которые специфично экспрессируются всемязачатках, мы сравнили уровень экспрессии генов PIN в семязачатках с ихуровнем экспрессии во взрослом растении M.

Характеристики

Список файлов диссертации