Диссертация (1145917), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Затем одиночную колонию высевали в 5 мл жидкойсреды LB и инкубировали при 37оС на шейкере (200 об/мин) в течение ночи.Утром 2 мл ночной культуры добавляли к 30 мл жидкой среды LB и инкубировалинесколько часов до оптической плотности OD600=0,5-1,0. Затем культуруинкубировали на льду в течение 10 минут, осаждали центрифугированием (15мин, 4000 об/мин, 4°С) и ресуспендировали в 10 мл холодного раствора 0,1 МCaCl2. Клетки инкубировали на льду в течение 10-15 минут, осаждалицентрифугированием в тех же условиях и ресуспендировали в 5 мл холодного64раствора 0,1М CaCl2 с добавлением 15% (в./об.) глицерола.
Из полученнойсуспензии делали аликвоты объёмом 100-200 мкл, замораживали в жидком азоте ихранили при -80°С.Приготовление компетентных клеток бактерий A. tumefaciens проводили последующему протоколу:Клетки A. tumefaciens рассевали на чашку с твёрдой средой YEP ивыращивали в течение двух дней. Затем одиночную колонию высевали в 5 млжидкой среды YEP и инкубировали при 30оС на шейкере (200 об/мин) в течениепримерно 36 часов. Затем 2 мл ночной культуры добавляли к 30 мл жидкой средыYEP и инкубировали несколько часов до оптической плотности OD600=0,5-1,0.Затем культуру инкубировали на льду в течение 10 минут, осаждалицентрифугированием (15 мин, 4000 об/мин, 4°С) и ресуспендировали в 10 млхолодного раствора 0,1 М CaCl2.
Клетки инкубировали на льду в течение 10-15минут, осаждали центрифугированием в тех же условиях и ресуспендировали в 5мл холодного раствора 0,1 М CaCl2 с добавлением 15% (в./об.) глицерола. Изполученной суспензии делали аликвоты объёмом 100-200 мкл, замораживали вжидком азоте и хранили при -80°С.Трансформацию бактерий E.
сoli проводили по следующему протоколу:размораживали во льду фасовку компетентных клеток (100-200 мкл). Кзамороженным клеткам добавляли лигазную смесь, аккуратно перемешивали.Пробирку инкубировали во льду в течение 20-30 минут, после этого помещалипробирку в термостат на 42оС на 30 секунд с последующим резким охлаждениемна льду. Добавляли 1 мл жидкой среды LB и инкубировали в течение часа нашейкере (200 об/мин) при температуре 37оС, после чего клетки собираликратковременным центрифугированием (2 мин, 4000 об/мин) и ресуспендировалив небольшом количестве жидкой среды LB.
200 мкл бактерий высевали населективную твердую среду LB, содержащую соответствующий антибиотик.Чашки инкубировали при температуре 37оС в течение ночи.Трансформацию бактерий A. tumefaciens проводили согласно следующемупротоколу.65Размораживали на льду фасовку компетентных клеток (100-200 мкл),добавляли 1-5 мкл плазмиды, инкубировали на льду в течение 30 минут,перемешивая каждые 10 минут, помещали в жидкий азот на 60 секунд, затеминкубировали в термостате при температуре 37оС в течение 5 минут, добавляли500 мкл жидкой среды YEP и инкубировали при 30оС на шейкере (200 об/мин) втечение 1-3 часов. Клетки собирали кратковременным центрифугированием (2мин, 4000 об/мин), сливали супернатант и ресуспендировали в оставшейся впробирке жидкой YEP. Затем бактерии высевали на селективную твёрдую средуYEP, содержащую соответствующий антибиотик.
Чашки инкубировали притемпературе 30оС в течение 2 дней.Трансформацию дрожжей проводили согласно следующему протоколу:Высевали на чашку с твёрдой средой YPAD клетки S. cerevisiae (штамм Y2HGold) из перманентного стока и выращивали при 30оC в течение 3 дней. Однуколонию высевали в жидкую среду и инкубировали при 30оС на шейкере (200об/мин) в течение ночи. Утром 2-3 мл ночной культуры помещали в 25 мл средыYPAD и инкубировали при 30оС на шейкере (200 об/мин) в течение 2-4 часов.Культуру осаждали центрифугированием в течение 5 минут при скорости 2500об/мин, супернатант сливали. Осадок ресуспендировали в 700 мкл раствора дляприготовления компетентов (5 мМ трисHCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 М ацетат лития).
Изполучившейся суспензии брали по 50 мкл на каждую трансформацию. К 50 мклсуспензии добавляли необходимую плазмиду (100-500 нг), 20 мкл балластнойДНК (5 мг/мл) и 350 мкл раствора для трансформации (40% полиэтиленгликоль,10 мМ трисHCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1 М ацетат лития), перемешивали и инкубировалив течение 30 минут при 30оС. Затем пробирку помещали на водяную баню стемпературой 42оС на 7 минут.
После этого пробирку центрифугировали прискорости 13000 об/мин в течение 30 секунд, сливали супернатант, добавляли 800мклстерильнойцентрифугироваливодыипритехресуспендировалижеусловиях,осадок.сливалиПробиркусупернатант,сноваосадокресуспендировали в 100 мкл воды и высевали на чашку с селективной средой.Чашки инкубировали в течение 3 дней при 30оС.66Эксперименты с использованием дрожжевой двугибридной системыпроводили согласно Lu et al., 2010.
Кодирующие последовательности двух белков,взаимодействиекоторыхнеобходимобылопроверить,клонировали,соответственно, в вектор pGADT7, содержащий активаторный домен белка GAL4,и в вектор pGBKT7, содержащий ДНК-связывающий домен белка GAL4.Полученными двумя плазмидами трансформировали S. cerevisiae (штамм Y2HGold, Clontech) и выращивали на твёрдой селективной среде DDO для отборатрансформантов (на 1 л среды: смесь Yeast nitrogen base (Sigma) - 1,74 г, (NH4)2SO4- 5 г, глюкоза - 20 г, агар - 20 г, смесь “Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplementswithout leucine and tryptophan” (Sigma, Y0750) - 0,68 г, pH=5,9). Полученныеколонии высевали на селективные среды для оценки взаимодействия белков: TDO(состав аналогичен DDO, но вместо смеси Y0750 без триптофана и лейцина смесь Y2146 без триптофана, лейцина и гистидина) и QDO (состав аналогиченDDO, но вместо смеси Y0750 без триптофана и лейцина - смесь Y2021 безтриптофана, лейцина, гистидина и аденина).
Рост колоний на средах TDO и QDOговорил о взаимодействии белков.ЭкспериментыкомплементациисиспользованиемпроводилисогласнобимолекулярнойLuetal.,флуоресцентной2010.Кодирующиепоследовательности двух белков, взаимодействие которых необходимо былопроверить, клонировали, соответственно, в вектор Earleygate201-YN, содержащийN-концевую часть белка YFP, и в вектор pEarleygate202-YC, содержащий Cконцевую часть белка YFP. Полученными плазмидами трансформировали (поотдельности)штаммAgrobacteriumtumefaciensGW2260.Полученныхтрансформантов рассевали на твёрдую среду LB с необходимыми антибиотикамии выращивали в течение 2 суток при температуре 30оС.
Одну колонию высевали вжидкую среду LB с необходимыми антибиотиками и инкубировали при 30оС нашейкере (200 об/мин) в течение ночи. 50 мкл ночной культуры добавляли к 10 млLB с 10 мМ MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid, 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), 2 мкМ ацетосирингоном и соответствующимиантибиотиками. Полученную культуру инкубировали при 30оС на шейкере (20067об/мин) в течение 16 часов.
Затем бактерии осаждали центрифугированием при4000 об/мин в течение 10 минут, сливали супернатант, ресуспендировали в 10 мл10mM MgCl2 и добавляли к суспензии 2 мкл 100 мМ ацетосирингона. Полученнуюкультуру инкубировали при комнатной температуре в течение 3-5 часов. Культуры,трансформированныевекторамискодирующимипоследовательностямианализируемых белков, смешивали. Затем полученную смесь помещали в шприцна 2 мл без иглы и инфильтрировали листья растений N. benthamiana (возрастомоколо 4 недель). Растения выращивали в течение ещё 2 суток и затем листьяанализировали с помощью конфокального микроскопа.
Жёлтое свечение(опосредованное наличием в клетках листа функционального белка YFP) говорилоо взаимодействии белков.Для создания векторных конструкций использовали ферменты Gateway BPClonase II Enzyme mix (Thermo Scientific) и LR Clonase II Plus enzyme (ThermoScientific) в соответствии с инструкциями производителя.В таблицах 2 и 3 представлены использованные в работе плазмиды ипраймеры, соответственно.Таблица 2.
Плазмиды, использованные в работеПлазмидаПрименение в настоящей работеpKm43GWСозданиевекторныхконструкцийИсточникдля Исследовательскийтрансформации растений и визуализации институтэкспрессии, вектор назначенияpDONR P4- СозданиеP1rвекторныхконструкцийвГенте,Бельгиядля докторДэвидтрансформации растений и визуализации О'Коннорэкспрессии, вектор ввода(КембриджскийУниверситет,Великобитания)pDONRСозданиевекторныхконструкцийдля докторP2r-P3трансформации растений и визуализации О'КоннорДэвид68экспрессии, вектор ввода(КембриджскийУниверситет,Великобитания)p369entry-Созданиевекторныхконструкцийдля Вагенингенскийcloneтрансформации растений и визуализации университет,экспрессии, вектор вводавекторных(Нидерланды).pMD143Созданиеконструкцийдля МоникаДемар(pDONR22трансформации растений и визуализации (Институт1+экспрессии STENOFOLIA и MtWOX9-1, Планка, Германия)mCherryNLвектор с флуоресцентным белком mCherryМаксаS)pMD143Созданиевекторныхконструкций(pDONR22трансформации растений и визуализации (Институт1+GFP-экспрессииNLS)флуоресцентным белком GFPpDONR221Создание+Citrineтрансформации растений и визуализации О'КоннорMtWOX11-like,векторныхдля МоникаМаксас Планка, Германия)векторконструкцийДемардля докторДэвидэкспрессии SMOOTH LEAF MARGIN 1, (Кембриджскийвектор с флуоресцентным белком CitrineУниверситет,Великобитания)pGBKT7Оценка взаимодействия белков с помощью доктордрожжевой двугибридной системыЮхаи(ЗападныйКуиИнститутСельского Хозяйства иПродовольствия,Канада)pGADT7Оценка взаимодействия белков с помощью доктордрожжевой двугибридной системыЮхаи(ЗападныйКуиИнститутСельского Хозяйства иПродовольствия,69Канада)pGBKT7+SОценка взаимодействия ТФ STF с другими ДокторTFбелкамиспомощьюМиллиондрожжевой Тадегедвугибридной системы(ГосударственныйУниверситетОклахомы, США)pGBKT7+Оценка взаимодействия ТФ MtWOX9-1 с ДокторMtWOX9-1другими белками с помощью дрожжевой Тадегедвугибридной системыМиллион(ГосударственныйУниверситетОклахомы, США)pEarleyagteОценка взаимодействия белков с помощью доктор201-YNбимолекулярнойЮхаифлуоресцентной (ЗападныйкомплементацииКуи,ИнститутСельского Хозяйства иПродовольствия,Канада)pEarleygateОценка взаимодействия белков с помощью доктор202-YCбимолекулярнойЮхаифлуоресцентной (ЗападныйкомплементацииКуи,ИнститутСельского Хозяйства иПродовольствия,Канада)pEarleyagteОценка взаимодействия ТФ STF с другими Доктор201-белкамиYN+STFфлуоресцентной комплементацииспомощьюМиллионбимолекулярной Тадеге(ГосударственныйУниверситетОклахомы, США)pEarleygateОценка взаимодействия ТФ STF с другими Доктор202-белкамиYC+STFфлуоресцентной комплементацииспомощьюМиллионбимолекулярной Тадеге(Государственный70УниверситетОклахомы, США)pEarleyagteОценка взаимодействия ТФ MtWOX9-1 с Доктор201-другимиYN+MtWOбимолекулярнойX9-1комплементациибелкамисМиллионпомощью Тадегефлуоресцентной (ГосударственныйУниверситетОклахомы, США)pEarleygateОценка взаимодействия ТФ MtWOX9-1 с Доктор202-другимиYC+MtWOбимолекулярнойX9-1комплементациибелкамисМиллионпомощью Тадегефлуоресцентной (ГосударственныйУниверситетОклахомы, США)Таблица 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
