Диссертация (1145917), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессиигена STF»)В то же время, для гена SLM1 была показана иная динамика экспрессии входе СЭ: высокий уровень на этапе каллусообразования, постепенное снижение инебольшое увеличение на этапе формирования соматических эмбрионов (см.Рисунок 3 в разделе 3.1.2. Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе»).Сопоставив эти данные, можно предположить, что по меньшей мере насроке 30 дней каллусы со сверхэкспрессией MtWOX9-1 находятся ( по сравнениюс каллусами дикого типа) на другой стадии развития, более близкой кформированию соматических эмбрионов, так как уровни экспрессии в них рядагенов, ассоциированных с СЭ, соответствуют более поздним этапам развитиякаллуса.
И действительно, в дальнейшем возникновение соматических эмбрионову таких каллусов наблюдается на более ранних сроках. На сроке 60 дней,эмбрионы в каллусах со сверхэкспрессией MtWOX9-1oe находятся на болеепоздней стадии развития, чем в случае дикого типа, и, вероятно, уровеньэкспрессии ряда генов, ассоциированных с СЭ, уже начинает снижаться (раньше,чем это происходит в каллусах дикого типа).Повышенный уровень экспрессии STF на стадии 60 дней, на наш взгляд,также говорит о более поздней стадии развития каллусов со сверхэкспрессиейMtWOX9-1: согласно полученным нами данным, STF активируется в ходе СЭочень постепенно и лишь на поздних стадиях СЭ его уровень экспрессии110становится достоверно отличимым от такового в неэмбриогенной линии (см.Рисунок 4 в разделе «3.1.2. Количественный анализ экспрессии генов WOXMedicago truncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе»).В настоящий момент сложно сказать, является ли какой-либо изисследованных генов мишенью MtWOX9-1 в ходе СЭ.
Скорее всего, измененияуровня экспрессии большинства их них являются следствием изменённогосостояния каллуса, а не непосредственной активации транскрипции за счётMtWOX9-1.Дальнейший более подробный анализ, в частности, полный анализтранскриптома каллуса со сверхэкспрессией MtWOX9-1, позволит выявить другиегены с изменённой экспрессией и, возможно, мишени этого ТФ.Рисунок 14. Уровни экспрессии генов MtWOX11-like (а), STF (б), SLM1 (в),MtAGL15 (г), MtSHR (д), MtLEC1A (е) в каллусах дикого типа (серые столбцы) и111каллусахсосверхэкспрессией(белыеMtWOX9-1столбцы)насрокахкультивирования 30 дней и 60 дней. Планки погрешностей указываютстандартные отклонения.
Эксперимент проводили в двух биологическихповторностях.3.2.2.3. Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функциигена MtWOX11-likeДля изучения функций гена MtWOX11-like мы приобрели семена растений,предположительно содержащих вставку транспозона Tnt1 в этом гене, изколлекцииинсерционныхмутантовM.truncatula(http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) (Tadege et al., 2008) – линию NF8274.Согласноданным,полученнымврезультатесеквенированияпоследовательностей, фланкирующих вставку транспозона, в данной линиивставка Tnt1 в гене MtWOX11-like находится приблизительно в районе 2286 н.п.,начиная со стартового кодона (общая длина гена – 4310 н.п.).
Мы подобралипраймеры для выявления растений, содержащих аллель MtWOX11-like со вставкойтранспозона, а также для выявления гомозиготных мутантов по MtWOX11-like (см.Рисунок 15).Рисунок15.Схемапраймеровдлягенотипированиямутантовстранспозонной вставкой Tnt1.
Чёрным цветом обозначен ген со вставкой. Белымцветом обозначена транспозонная вставка. Пара «Праймер 1 + Праймер 2» (атакже пара «Праймер 2 + Праймер 3» в случае обратной ориентации транспозона)использовалась для выявления наличия в геноме растения вставки Tnt1 висследуемом гене. Пара «Праймер 1+Праймер 3» использовалась для выявлениягомозиготных мутантов. При наличии транспозонной вставки в гене при112используемых условиях ПЦР (Taq-полимераза, время элонгации - 40 секунд)данная пара не даёт продукт, так как праймеры расположены друг от друга нарасстоянии более 5000 н.п.
Если транспозонной вставки в гене нет, продуктобразуется.Генотипирование имеющихся у нас растений линии NF8274 показало, чтобольшинство из них являются гомозиготными мутантами по гену MtWOX11-like(mtwox11-like). ОТ-ПЦР с кДНК, выделенной из каллусов, полученных из этихрастений, подтвердила отсутствие экспрессии MtWOX11-like в мутантныхрастениях (Рисунок 16).
Фенотип мутантных растений не отличался от фенотипарастений дикого типа.Рисунок 16. (а) Результаты ПЦР для проверки наличия вставки транспозонаTnt1 в MtWOX11-like в геноме растений. 1 – маркер, 2-4 – растения линии NF8274,5 – растение дикого типа. Наличие продукта размером около 220 н.п.свидетельствует о присутствии вставки. (б) Результаты ПЦР для проверкигомозиготности растений линии NF8274. 6 – маркер, 7-9 – растения линииNF8274, 10 –растение дикого типа.
Отсутствие продукта свидетельствует оботсутствии в геноме интактной копии MtWOX11-like. (в) Результаты ОТ-ПЦР скДНК, полученной из каллусов на сроке культивации 60 дней для проверкиотсутствия экспрессии гена MtWOX11-like в растениях NF8274, в геноме которыхотсутствует интактная копия MtWOX11-like. 11-12 - каллусы дикого типа. 13-14 каллусы mtwox11-like на сроке культивации 60 дней113Мы получили каллусы этих растений и сравнили интенсивность СЭ стаковой у каллусов растений дикого типа. Было проанализировано 60 каллусовmtwox11-like и 17 каллусов дикого типа. Нам не удалось выявить каких-либоразличий в интенсивности СЭ между мутантными растениями и диким типом(Рисунок 17).Рисунок 17.
(а) Каллусы с образующимися соматическими эмбрионами.Слева — каллусы дикого типа. Справа — каллусы mtwox11-like. (б) Средняя доляповерхности каллуса, занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа и каллусовmtwox11-like. Ошибки отражают доверительные интервалы, рассчитанные спомощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).Эти результаты позволяют утверждать, что, несмотря на активациюэкспресcии в ходе СЭ, функции MtWOX11-like не являются необходимыми дляэтого процесса. Возможно, другие ТФ из семейства WOX выполняют ту же роль вСЭ и замещают действие MtWOX11-like в случае потери его функции.3.2.2.4.
Поиск белков, взаимодействующих странскрипционными факторами STF и MtWOX9-1 и важных дляСЭСпомощьюдрожжевойдвугибриднойсистемымыпровериливзаимодействие ТФ STF и MtWOX9-1 с другими ТФ, которые, предположительно,участвуютвэмбриогенезе.МывыбралигеныM.truncatulaMtBBM1(Medtr7g080460), MtBBM3 (Medtr4g065370), MtAGL15A (Medtr4g109830), MtSHR(Medtr4g097080),MtLEC1A(Medtr1g039040),MtMINI3(Medtr3g009470)иMtFUS3(Medtr7g059330), близкие гомологи соответствующих генов A. thaliana,114согласно базе данных Phytozome.Все эти гены A.
thaliana кодируют транскрипционные факторы, связанные сЗЭ или СЭ. В частности, сверхэкспрессия LEC1, BABYBOOM и AGL15 приводит кформированию эктопических соматических эмбрионов (Thakare et al., 2008,Boutilier et al., 2002, Lotan et al., 1998), LEC1 и FUS3 обеспечивают устойчивостьсемян к высыханию (Fehér, 2015), MINI3 важен для развития эндосперма, а такжеэкспрессируется на ранних стадиях развития зиготического эмбриона (Luo et al.,2005), SHORT-ROOT необходим для радиальной дифференцировки тканей корня вэмбрионе (Jenik et al., 2007).Мы клонировали кодирующие последовательности перечисленных вышегенов M. truncatula в вектор pGADT7, содержащий последовательность,кодирующую активирующий домен GAL4.
Далее мы проверили взаимодействиекодируемых этими генами ТФ с белками STF и MtWOX9-1 (плазмидыpGBKT7+STF и pGBKT7+MtWOX9-1, содержащие ДНК-связывающий доменGAL4 и кодирующие последовательности генов STF и MtWOX9-1, соответственно,были любезно предоставлены доктором Миллионом Тадеге, ГосударственныйУниверситет Оклахомы, США).Согласно полученным нами данным, STF и WOX9-1 не взаимодействуют сMtBBM1, MtBBM3, MtMINI3, MtFUS3, MtSHR и MtAGL15, однако они обавзаимодействуют с MtLEC1A (Рисунок 18). Наблюдаемое взаимодействие STF иWOX9-1сMtLEC1A,повидимому,неявляетсяложноположительнымрезультатом, поскольку аналогичный эксперимент, проведённый с вектором,содержащим кодирующую область MtLEC1A, и контрольным вектором (pGBKT7),не привёл к росту колоний дрожжей на селективной среде (данные непредставлены).115Рисунок 18.
Результаты анализа взаимодействия белков с использованиемдрожжевой двугибридной системы. Рост колонии S. cerevisiae на селективнойсреде указывает на взаимодействие указанных в таблице белков.Далее мы проверили взаимодействие STF и MtWOX9-1 с MtLEC1A спомощью метода BiFC (бимолекулярная флуоресцентная комплементация). Дляэтого мы клонировали кодирующую последовательность гена MtLEC1A в векторыpEarleygate201-YN и pEarleygate202-YC, присоединив таким образом к нейпоследовательность, кодирующую либо N-терминальный, либо C-терминальныйфрагмент флуоресцентного белка YFP. Плазмиды pEarleygate201-YN+STF,pEarleygate202-YC+STF,pEarleygate201-YN+MtWOX9-1,pEarleygate202-YC+MtWOX9-1, содержащие N- или С-терминальные фрагменты YFP икодирующие последовательности генов STF и MtWOX9-1, были любезнопредоставлены доктором Миллионом Тадеге, Государственный УниверситетОклахомы, США).Затем мы трансформировали листья Nicotiana benthamiana четырьмясочетаниями этих плазмид:1) pEarleygate201-YN+MtWOX9-1 и pEarleygate202-YC+MtLEC1A2) pEarleygate202-YC+ MtWOX9-1 и pEarleygate201-YN+MtLEC1A3) pEarleygate201-YN+STF и pEarleygate202-YC+MtLEC1A4) pEarleygate202-YC+STF и pEarleygate201-YN+MtLEC1AТаким образом, в случае взаимодействия анализируемых ТФ в клеткахтабака образовывался бы полноценный белок YFP, способный к свечению.Полученные результаты не подтвердили взаимодействие STF и MtLEC1A116(данные не представлены), однако взаимодействие MtWOX9-1 и MtLEC1Aподтвердилось в обоих исследованных сочетаниях (MtWOX9-1+С-терминальныйконец YFP и MtLEC1A+N-терминальный конец YFP, и наоборот) (Рисунок 19).Рисунок 19.
Результаты бимолекулярной флуоресцентной комплементации.(а) Клетки N. benthamiana, трансформированные конструкциями pEarleygate201YN+MtWOX9-1 и pEarleygate202-YC+MtLEC1A. (б) Клетки N. benthamiana,трансформированныеконструкциямиpEarleygate202-YC+MtWOX9-1иpEarleygate201-YN+MtLEC1A. Желтое свечение ядер указывает на образованиефункционального белка YFP вследствие взаимодействия указанных ТФ.Таким образом, MtWOX9-1 взаимодействует с MtLEC1A в клеткахрастений.3.2.2.5. Анализ функций гена MtLEC1A в СЭДля изучения функций гена MtLEC1A мы приобрели семена растений,предположительно содержащих вставку транспозона Tnt1 в этом гене, изколлекцииинсерционныхмутантовM.truncatula(http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) (Tadege et al., 2008) – линию NF7292.Согласноданным,полученнымврезультатесеквенированияпоследовательностей, фланкирующих вставку транспозона, в данной линиивставка Tnt1 находится приблизительно в районе 114 н.п., начиная со стартового117кодона (общая длина гена – 573 н.п.).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
