Диссертация (1145903), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Происходит выход Са2+ из Cа2+-депо в цитозоль. Опустошённые депо генерируют факторвхода Са2+ (CIF) (2) путём разрезания более крупного предшественника или синтеза из болеемелкого (3, 4; вставка б). CIF высвобождается в цитоплазму (5) и диффундирует кплазматической мембране (6, вставка a). CIF вызывает отсоединение кальмодулина (СаМ) (7)от Са2+-независимой фосфолипазы А2 (iPLA2) (8) и активацию последней. iPLA2 начинаетпродуцировать лизофосфолипиды (lysophospholipids; LysoPL) (9), которые повышаютактивность депо-зависимых каналов (SOC) (10) в плазмалемме и, таким образом, индуцируютвход Са2+ по депо-зависимому механизму (1).
Ионы Са2+, оказавшиеся в цитозоле в большомколичестве в результате мобилизации и входа Са2+, закачиваются обратно в депо с участиемСа2+-АТФаз сарко/эндоплазматического ретикулума (SERCA).Depleted Ca2+ stores – опустошённые Са2+-депо; Endoplasmic reticulum –эндоплазматический ретикулум; iPLA2 - Са2+-независимая фосфолипаза А2; Plasma membrane –плазматическая мембрана.273) Модели встраивания везикулМодели, описанные выше, основываются на том, что депо-зависимые Са2+-каналыстационарно локализованы в плазматической мембране. Однако некоторые исследователипредположили, что активация емкостного входа Са2+ может являться результатом встраиванияв мембрану везикул, содержащих депо-зависимые каналы (Fasolato et al., 1993; Somasundaram etal., 1995).
Согласно данной модели, когда Са2+-депо заполнены, везикулы с депо-зависимымиканалами находятся в цитоплазме под плазмалеммой (рис. 6в). При опустошении депоактивируется транспорт этих везикул, слияние их с плазматической мембраной, встраивание внеё каналов и, как следствие, активация депо-зависимого входа Са2+ (Somasundaram et al., 1995)Эта модель объясняет участие в активации депо-зависимого входа Са2+ малых G-белков,которые играют ключевую роль в регуляции везикулярного транспорта (Somasundaram et al.,1995).По-видимому,описанныевышемоделинеследуетрассматриватькаквзаимоисключающие, и истинный механизм депо-зависимого входа Са2+ включает в себяэлементы всех моделей.
Такой подход отражён в новой модели, получившей название«связывание по типу секреции» (secretion-like coupling model) (рис. 9).4) Модель «связывания по типу секреции» (secretion-like coupling model)Данная модель, впервые предложенная для тромбоцитов человека, предполагает прямое(физическое), но обратимое связывание внутриклеточного Са2+-депо с плазматическоймембраной за счёт «подтягивания» депо к мембране (рис. 8) (Rosado, Sage, 2000). Транслокациядепокплазмалеммерегулируетсяпримембраннымцитоскелетом.Согласномодели«связывания по типу секреции», опустошение депо вызывает активацию и транслокацию кплазмалемме малых G-белков (Rosado, Sage, 2000). Активированные G-белки запускаютполимеризацию актиновых филаментов, которые «подтягивают» депо к плазматическоймембране.
Кроме того, G-белки активируют фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ3К) ифосфатидилинозитол-4-киназы(ФИ4К),которыетакжерегулируютклеточныйпулфосфоинозитидов и динамичную реорганизацию актина (Rosado, Sage, 2000). При этом IP3рецепторы депо оказываются колокализованными с депо-зависимыми Са2+-каналами иактивируют их за счёт прямых (физических) взаимодействий (Rosado, Sage, 2000).На кафедре биофизики СПбГУ показано, что «связывание по типу секреции» являетсянаиболее вероятной действующей моделью депо-зависимого входа Са2+ в перитонеальныхмакрофагах крысы (Курилова и др., 2006, 2007). Для этих клеток показано, что ключевымиучастниками депо-зависимого входа Са2+ в макрофаги являются актиновые филаменты, малыеG-белки суперсемейства Ras (Курилова и др., 2006) и ФИК (Курилова и др., 2007).28Рис.
8. Модель депо-зависимого входа Са2+ в тромбоциты человека: «связывание потипу секреции» (по Rosado, Sage, 2000 с модиф.)Опустошение внутриклеточных Са2+-депо индуцирует активацию и транслокацию кплазматической мембране малых G-белков суперсемейства Ras. Ras-белки запускаютполимеризацию актиновых филаментов, которые участвуют в «подтягивании» Са2+-депо кплазматической мембране. При этом IP3-рецепторы в мембране депо и Са2+-каналы вплазмалемме, вероятно, взаимодействуют за счёт прямых белок-белковых взаимодействий ипроисходит активация депо-зависимого входа Са2+ в клетку. Воздействие Ras-белков наактиновый цитоскелет может быть также опосредовано фосфатидил-3- и -4-киназами (PI3kinase, PI4-kinase).
Кроме того, представитель суперсемейства Ras Arf участвует вопосредованном актиновыми филаментами внутриклеточном транспорте.292.1.3.2. Биофизические характеристики депо-зависимых Са2+-каналовБиофизические характеристики депо-зависимых Са2+-каналов исследованы с помощьюметода patch-clamp в конфигурации «whole-cell» в таких невозбудимых клетках, как тучныеклетки (Hoth, Penner, 1992), лейкемические базофилы (Parekh, Penner, 1995), Т-клетках линииJurkat (Zweifach, Lewis, 1993; Kerschbaum, Calahan, 1998). Ток, текущий через депо-зависимыеСа2+-каналы, обозначают как ICRAC (calcium-release-activated calcium current, Са2+-ток,активируемый выбросом Са2+), а сами каналы – как CRAC-каналы (calcium-release-activatedcalcium channel, Са2+-каналы, активируемые выбросом Са2+).
Icrac активируется пригиперполяризации мембраны, имеет свойства входящего выпрямления и потециал реверсии,более положительный, чем +50 мВ (Hoth, Penner, 1992, 1993).CRAC-каналы обладают высокой селективностью для ионов Са2+ по сравнению с Ba2+,Sr2+ и Mn2+ (Hoth, Penner, 1992). При этом их отличает низкая проводимость (около 24 фСм)(Zweifach, Lewis, 1993). При уменьшении внеклеточной концентрации двухвалентных катионовCRAC-каналы становятся проницаемыми для моновалентных катионов (Hoth, Penner, 1993;Kerschbaum, Calahan, 1998). Исследование селективности CRAC-каналов для различныхорганических катионов позволило оценить размер их селективного фильтра, диаметр которогосоставляет около 0,6 нм (Kerschbaum, Calahan, 1998).2.1.3.3. Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-каналовПри исследовании фоторецепции у Drosophila был обнаружен ген trp (transiеnt receptorpotential), продукт которого (TRP-белок) обеспечивает проницаемость мембраны для Са2+(Phillips et al., 1992).
Экспрессия TRP-белков Drosophila в клетках линии Sf9 показала, что ониформируют малоселективные катионные каналы, проницаемые для Ca2+ и Na+. Кроме того,была выявлена высокая степень сходства аминокислотной последовательности между ТRPканалами и потенциал-зависимыми Са2+-каналами (Phillips et al., 1992). ТRP-канал содержит 6трансмембранных сегментов (S1 – S6), порообразующий участок SS1 – SS2 между сегментамиS5 и S6, 2 кальмодулин-связывающих сайта и анкирин-подобный домен (Phillips et al., 1992).Было установлено, что эти каналы активируются в ответ на опустошение Са2+-депо привоздействии тапсигаргина (Vaca et al., 1994).Гомологи trp-генов идентифицированы в клетках позвоночных животных.
Так, известносуперсемейство TRP-белков млекопитающих, которое включает в себя 6 семейств:«канонические» (canonical, TRPC), «ванилоидные» (vanilloid, TRPV), «меластатиновые»30(melastatin, TRPM), связанные с поликистозной болезнью почек (polycystic kidney disease, TRPP,PKD), «муколипиновые» (mucolipin, TRPML), «анкириновые» (ankyrin, TRPA) (Gees et al.,2010). Это малоселективные катионные каналы, большинство из которых проницаемы дляионов Са2+. TRP-белки млекопитающих также содержат 6 трансмембранных сегментов,порообразующий фрагмент между сегментами S5 и S6 и до 4 анкирин-подобных домена (рис. 9)(Zhu, Birnbaumer, 1998; Gees et al., 2010).
Большинство TRP-каналов, возможно, представленыгомотетрамерами или гетеротетрамерами из разных TRP-белков в пределах одногоподсемейства (Zhu, Birnbaumer, 1998; Gees et al., 2010).TRP-белки активируются в ответ на целый ряд вне- и внутриклеточных стимулов:стимуляцию рецепторов, повышение температуры, осмотическое давление, механическоевоздействие и химические агенты (Vazquez et al., 2004; Kozai et al., 2014).
Воспринимаемыесигналы затем преобразуются TRP-белками в электрические и химические сигналы за счётизменения мембранного потенциала или [Ca2+]i. Например, TRPC-каналы активируются в ответна запуск сигнального каскада с участием мембранных рецепторов, фосфолипазы С (ФЛС) ивторичных посредников IP3 и ДАГ (Vazquez et al., 2004). TRPV-каналы, изначальноидентифицированные как рецепторы ванилоидного соединения капсаицина, чувствительны кнагреванию (> 43 °С), концентрации H+ и анандамиду, а также к активации ФЛС (Vazquez et al.,2004; Kozai et al., 2014).Для ряда белков семейства TRPС (в первую очередь, TRPC 1, 3, 4, 7) было установленоучастие в депо-зависимом входе Са2+ (Targos et al., 2005). Так, было показано, что эндогенныебелки TRPC 1, 3, 4 могут формировать гомотетрамерные и гетеротетрамерные Са2+-каналы,которые активируются в ответ на опустошение Са2+-депо (Targos et al., 2005; Cheng et al., 2013).TRPC-каналы генерируют малоселективные катионные токи, характеризующиеся слабымвходящим выпрямлением и значениями потенциала реверсии в пределах от 0 до +15 мВ (Chenget al., 2013).
Наибольшую селективность для ионов Са2+ имеют каналы, образованные белкамиTRPC 1, 3, 4. Проводимость для одиночных TRPC-каналов варьирует в широких пределах: от 2– 5 пСм для эндогенных каналов TRPC1 и TRPC5 до ~83 пСм (Cheng et al., 2013). Токи черезTRPC-каналы получили название ISOC (store-operated current, депо-зависимый ток), чтобыотличить их от ICRAC – Са2+-токов с сильным входящим выпрямлением через CRAC-каналы,характеризующиеся высокой селективностью и низкой проводимостью для Са2+ (Targos et al.,2005; Cheng et al., 2013).31Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
