Диссертация (1145903), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Продуктыметаболизма АК (эйкозаноиды) - это вторичные посредники, которые участвуют в регуляциивоспаления, аллергических реакций и целого ряда других физиологических функций клеток итканей (Needleman et al., 1986; Lapetina, 1990).Воздействие на макрофаги внеклеточных стимулов также приводит к динамичнымперестройкам актинового цитоскелета (Rougerie et al., 2013). Актиновые филаменты участвуютв таких функциях макрофагов, как хемотаксис, фагоцитоз и презентация антигенов (Rougerie etal., 2013).
Ранее на кафедре биофизики СПбГУ было впервые выявлено, что актиновыефиламенты участвуютвформированииСа2+-ответов,индуцируемыхглутоксимомимоликсаном в перитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др, 2011; Курилова и др,2012б). Морфологические исследования показали, что глутоксим и моликсан вызываютреорганизацию актинового цитоскелета в макрофагах (Курилова и др, 2012б; Kurilova et al.,2013).Ключевым участником процессов полимеризации и ветвления микрофиламентовявляется комплекс белков Arp 2/3 (actin-related proteins, белки, связанные с актином), который, всвою очередь, активируется белками WASP (Wiskott – Aldrich syndrome proteins, белкисиндрома Вискотта - Олдрича) (Pollard, Borisy, 2003; Rougerie et al., 2013).Известно, что каскад метаболизма АК, а также такие элементы актинового цитоскелета,как актин-связывающие белки, играют важную роль в сигнальных процессах с участием ионовСа2+ в различных типах клеток (Peppelenbosch et al., 1992; Joseph et al., 2014).Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось изучение роликаскада метаболизма арахидоновой кислоты и элементов актинового цитоскелета (актинсвязывающих белков) в действии препаратов-иммуномодуляторов глутоксим и моликсан на[Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы.Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:1) изучить участие ключевого фермента каскада метаболизма АК фосфолипазы А2 вдействии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в перитонеальных макрофагах крысы;2) изучить участие циклооксигеназного, липоксигеназного и эпоксигеназного путейокисления АК в регуляции Са2+-ответов, вызываемых глутоксимом и моликсаном в макрофагах;3) исследовать участие актин-связывающих белков WASP и Arp 2/3-комплекса вдействии препаратов глутоксим и моликсан на [Ca2+]i в макрофагах.9Основные положения, выносимые на защиту:1.
Структурно различные ингибиторы фосфолипазы А2 (4-бромфенацилбромид,дексаметазон, преднизолон) вызывают существенное подавление Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы, что свидетельствует обучастии фосфолипазы А2 и каскада метаболизма АК в процессах Са2+-сигнализации,запускаемых глутоксимом и моликсаном в макрофагах.2.Ингибиторыциклооксигеназ(индометацин,аспирин),липоксигеназ(нордигидрогуаретиковая кислота, каффеиковая кислота, зилеутон, байкалейн) и эпоксигеназ(эконазол, проадифен) приводят к подавлению увеличения [Са2+]i, вызываемого глутоксимом имоликсаном в макрофагах.
Полученные результаты свидетельствуют об участии ферментови/или продуктов метаболизма АК в регуляции Са2+-ответов, вызываемых дисульфидсодержащими иммуномодуляторами в макрофагах.3. Ингибиторы белков WASP (вискостатин) и Arp 2/3-комплекса (соединение СК0499666) существенно подавляют увеличение [Са2+]i, вызываемое глутоксимом и моликсаном вмакрофагах, что свидетельствует об участии актин-связывающих белков в действии глутоксимаи моликсана на [Са2+]i в макрофагах.Научнаяновизнаработы.Сиспользованиемширокогоспектраагентов,ингибирующих фосфолипазы А2, циклооксигеназы, липоксигеназы и эпоксигеназы, впервыевыявлено участие основных путей метаболизма АК в действии иммуномодуляторов глутоксимаи моликсана на [Са2+]i в перитонеальных макрофагах крысы.
Впервые показано участие актинсвязывающих белков WASP и белков Arp 2/3-комплекса в регуляции Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом и моликсаном в макрофагах.Впервые предложены возможные механизмы участия каскада метаболизма АК иактиновых филаментов в сигнальном каскаде, запускаемом глутоксимом и моликсаном вперитонеальных макрофагах крысы.Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносятвклад в один из фундаментальных разделов клеточной биологии и биофизики - изучениепроцессов внутриклеточной сигнализации. Результаты исследования станут дополнением кобщей модели действия дисульфид-содержащих иммуномодуляторов, которая откроет широкиеперспективы для разработки новых эффективных лекарственных препаратов, а также дляусовершенствования существующих. Выявление клеточных механизмов действия препаратовглутоксим и моликсан позволит повысить эффективность использования этих препаратов втерапии бактериальных и вирусных инфекций, онкологических заболеваний и т.д.
Материалыдиссертации используются при чтении лекционных курсов «Биофизика», «Механизмывнутриклеточной сигнализации», «Биофизика клеточных процессов», «Основы медицинской10биофизики» и «Люминесцентный анализ клеток» для студентов кафедры биофизики ибиологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.Личный вклад автора. Результаты, включённые в работу, получены лично автором.Материалы, вошедшие в диссертацию, обсуждались и публиковались совместно с соавторами инаучным руководителем.Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на:VIII и IX Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010, 2015); VIII, Х и XIМеждународном симпозиуме «Biological Motility: Fundamental and Applied Science» (Пущино,2012, 2014, 2016); Международном симпозиуме по проблемам боли «Translational approaches tocause-oriented treatment of pain symptoms» (Санкт-Петербург, 2012); Международноймеждисциплинарной научной конференции «Биологически активные вещества и материалы:фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Крым, 2013);Всероссийском симпозиуме и школе-конференции для молодых учёных по биологии клетки вкультуре(Санкт-Петербург,2013);XXIIСъездеФизиологическогообществаимениИ.П.Павлова (Москва – Волгоград, 2013); Международной научно-методической конференции«Современные проблемы биофизики сложных систем.
Информационно-образовательныепроцессы» (Воронеж, 2013); Международной научно-практической конференции «Свободныерадикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013); V, VI, VII,VIII,IXМеждународнойнаучно-практическойконференции«Высокиетехнологии,фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург,2013, 2014, 2015, 2016); 18 и 19 Международной Пущинской школе-конференции молодыхучёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2014, 2015); Международной конференциимолодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика 2014» (Пущино, 2014); IIВсероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (СанктПетербург, 2015); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация»(Пущино, 2015); V Съезде биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015); 40 Конгрессе ФедерацииЕвропейских биохимических обществ (40th FEBS Congress) (Германия, Берлин, 2015).Публикации.
По теме диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе 1монография, 6 статей в рецензируемых журналах, 11 статей и 12 тезисов в материалахконференций.Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницахмашинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методовисследования, результатов и обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы,включающего 296 наименований. Текст работы иллюстрирован 55 рисунками и содержит 2таблицы.112.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ2.1. Механизмы кальциевой сигнализации в невозбудимых клетках2.1.1. Са2+ - универсальный вторичный посредник в живых клетках«Ja Kalzium, das ist alles!»(«Да, кальций – это всё!»)Otto Loewy, 1959В ходе эволюции живых организмов именно Са2+, благодаря своим уникальнымфизическим и химическим свойствам, стал универсальным вторичным посредником вэукариотических и прокариотических клетках (Jaiswal, 2001). Вероятно, к таким свойствамможно отнести высокое сродство ионов Са2+ к карбоксильным группам остатков глутаминовойи аспарагиновой кислот, которые в большом количестве содержатся в клеточных белках(Jaiswal, 2001).
Также Са2+ характеризуется быстрой кинетикой связывания и диссоциации отбелковых молекул и может образовывать 6 – 8 координационных связей, что позволяет этомуиону формировать лабильные комплексы с разнообразными белками. Са2+ необходим дляподдержания структуры цитоскелета, и многочисленные ферментативные системы используютэтот ион как кофактор (Jaiswal, 2001). Кроме того, Са2+ может влиять на организациюбиологических мембран, локально повышая их текучесть или способствуя их слиянию. Такимобразом, сигнальные процессы с участием Са2+ служат основой для регуляции процессовжизнедеятельности различных типов клеток (Berridge et al., 1998; Jaiswal, 2001; Putney, 2011).Впервые важная роль Са2+ как внутриклеточного регулятора была установлена вклассических экспериментах английского физиолога С.
Рингера в 1883 г. (Ringer, 1883). Рингерисследовал сокращение изолированных сердец крыс, помещённых в солевой раствор.Изначально для приготовления омывающего раствора использовалась жёсткая водопроводнаявода, содержащая большое количество солей кальция и магния: в такой среде сердцасокращались нормально (Ringer, 1883; Сarafoli, 2002). Однако, когда Рингер решил заменитьводопроводную воду на дистиллированную, он сделал удивительное открытие: сокращениясердец постепенно стали слабеть и через 20 минут совсем прекратились.
Позже он установил,что для возобновления сокращений в омывающий раствор необходимо добавить соли Са2+(Ringer, 1883; Сarafoli, 2002).Таким образом, Рингер случайно обнаружил, что Са2+, который до этого моментарассматривался только как структурный элемент биологических объектов, выполняет12принципиально иную функцию – передача сигнала, необходимого для сердечных сокращений(Ringer, 1883; Сarafoli, 2002).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
