Диссертация (1145903), страница 4
Текст из файла (страница 4)
3) (Berridge, Irvine, 1989; Zhu, Birnbaumer, 1998; Крутецкая и др.,2003).Внешний стимул (агонист) взаимодействует с рецепторами цитоплазматическоймембраны, ассоциированными с гетеротримерными Gq-белками (Neer, 1995; Zhu, Birnbaumer,1998). При активации рецептор изменяет конформацию, что приводит к активации Gq-белка.αq-Субъединица отщепляет ГДФ, связывает ГТФ и переходит в активированное состояние.
Приэтом происходит диссоциация Gq-белка на αq-субъединицу и βγ-димер (Neer, 1995).Активированная αq-субъединица стимулирует активность β-изоформы фосфолипазы С (ФЛСβ)- одного из ключевых ферментов фосфоинозитидной системы (Marshal, Taylor, 1993; Zhu,Birnbaumer,1998).ФЛСβкатализируетфосфатидилинозитол-4,5-дифосфатасгидролизобразованиемIP3мембранногоифосфолипидадиацилглицерола(ДАГ),выполняющих функцию вторичных посредников (Putney, Bird, 1993).Фосфоинозитидный путь может запускаться также при активации рецепторов ссобственной тирозинкиназной активностью. В этом случае генерация IP3 и ДАГ осуществляетсяс участием γ-изоформы ФЛС (ФЛСγ) (Marshal, Taylor, 1993; Nishizuka, 1995).Растворимый IP3 диффундирует в цитоплазме к мембранам внутриклеточных Са2+-депои активирует IP3-чувствительные Са2+-каналы, через которые Са2+ выходит из депо вцитоплазму (Berridge, Irvine, 1989).
Таким образом, запускается первая фаза Са2+-сигнала —мобилизация Са2+ из депо. В цитоплазме Са2+ связывается с кальмодулином, и этот комплексактивирует Са2+-кальмодулин-зависимую протеинкиназу, которая фосфорилирует белкимишени по остаткам серина и треонина (Berridge, Irvine, 1989). Влияние IP3 прекращается засчёт дефосфорилирования с участием фосфатаз (Berridge, Irvine, 1989).Гидрофобный ДАГ остаётся в мембране и активирует второй ключевой ферментфосфоинозитидного сигнального пути - серин-треониновую протеинкиназу С (ПКС) (Dieter,Fitzke, 1993; Nishizuka, 1995). ПКС катализирует присоединение фосфата к остаткам серина итреонина различных белков, таким образом, модулируя их активность.
Действие ДАГ такжеможет прекращаться при помощи различных механизмов. Так, ДАГ может фосфорилироватьсядиацилглицеролкиназойдофосфатиднойкислотыилиподвергатьсядействиюдиацилглицероллипазы, в результате чего происходит высвобождение остатка жирной кислотыво втором положении (Dieter, Fitzke, 1993).18Рис. 3. Фосфоинозитидный путь передачи сигнала (по Krutetskaya et al., 2014)Объяснения в тексте.Agonist – агонист; Ca2+-store - Ca2+-депо; DAG – диацилглицерол; G –гетеротримерный G-белок; Ca2+ channel – канал входа Ca2+; IP3 –инозитол-1,4,5трифосфат;IP3receptor–рецепторинозитол-1,4,5-трифосфата;PIP2–фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат; PKC – протеинкиназа С; PLCβ – фосфолипаза С (βизоформа); Receptor – рецептор плазматической мембраны; Store depletion signal – сигналопустошения депо.2.1.2.3.
Са2+-каналы, активируемые инозитол-1,4,5-трифосфатомМобилизация Са2+ в невозбудимых клетках происходит при связывании IP3 срецепторами, локализованными в мембране внутриклеточных Са2+-депо. Установлено, чторецептор к инозитол-1,4,5-трифосфату является одновременно Са2+-каналом (Marshal, Taylor,1993).IP3-рецептор был впервые выделен из клеток Пуркинье мозжечка млекопитающих иреконструирован в липосомы (Supattapone et al., 1988; Marshal, Taylor, 1993; Крутецкая и др.,2003). В настоящее время у млекопитающих и птиц идентифицировано 3 изоформы IP3-19рецептора.ФункциональноактивныйканалСа2+-выбросапредставляетгомо-илигетеротетрамер из 4 нековалентно связанных высококонсервативных субъединиц (Marshal,Taylor, 1993; Galvan et al., 1999).
Одиночная полипептидная цепь IP3-рецептора (313 кДа)содержит 6 трансмембранных сегментов, а также цитоплазматические N- и С-терминальныеучастки, которые играют важную роль в регуляции активности и воротных процессах Са2+канала (рис. 4) (Furuichi et al., 1989; Galvan et al., 1999).После связывания IP3 c лиганд-связывающим участком на N-конце мономера происходитзначительная конформационная перестройка рецептора, которая приводит к активации Са2+канала. В образовании поры Ca2+-канала принимают участие пятый и шестой сегменты вобласти С-конца каждой из 4 субъединиц (рис. 4) (Foskett et al., 2007).Детально изучены биофизические характеристики IP3-активируемых Са2+-каналов из ЭРтаких возбудимых клеток, как клетки Пуркинье мозжечка млекопитающих.
Са2+-канал IP3рецептора из ЭР клеток Пуркинье собаки имеет 4 проводящих подсостояния, которыехарактеризуются значениями проводимости 20, 40, 60, 80 пСм. Вероятно, это связано стетрамерной структурой канала (Bezprozvanny et al., 1991; Watras et al., 1991). Канал болееселективен для двухвалентных катионов по сравнению с одновалентными: например,соотношение проницаемости для Ва2+ и К+ составляет 6,3 (Bezprozvanny, Ehrlich, 1994).IP3-рецепторы являются мишенями для различных фармакологических агентов. Однимиз наиболее эффективных агонистов этих рецепторов является аденофостин А – соединение изPenicillum brevicompactum (DeLisle et al., 1997).
Ингибиторами IP3-рецепторов являютсягепарин (Supattapone et al., 1988; DeLisle et al., 1997), кофеин (Missiaen et al., 1992), этанол(Berridge, 1993), а также ксестоспонгин С (Gafni et al., 1997), а также ионы Mg2+, которыеспособны ингибировать связывание IP3 с IP3-рецептором и выход Са2+ через канал Са2+-выброса(Marshal, Taylor, 1993). Адениновые нуклеотиды (например, АТФ) в низких концентрацияхактивируют, а в высоких – ингибируют активность IP3-рецепторов (Marshal, Taylor, 1993).Зависимость выхода Са2+ из IP3-чувствительных внутриклеточных депо от [Ca2+]i имеетколоколообразный вид с оптимальной [Ca2+]i, равной 600 нМ (Bezprozvanny et al., 1991). Повидимому, высвобождение Са2+ из депо через каналы IP3-рецепторов происходит постепенно(steady-state release), причём по мере опустошения депо чувствительность рецепторов к IP3постепенно снижается (Missiaen et al., 1992).20Рис.
4. Структура IP3-чувствительного канала выброса Са2+ (по Foskett et al., 2007)На рисунке представлены 3 из 4 субъединиц функционально активного IP3-рецептора.Каждая субъединица включает 6 трансмембранных сегментов, а также крупный Nтерминальный и С-терминальный домены, обращённые в цитозоль. N-терминальный доменкаждой субъединицы содержит участок связывания инозитол-1,4,5-трифосфата (InsP3). Вобразовании поры Ca2+-канала принимают участие пятый и шестой сегменты, а такжелокализованный между ними Р-участок каждой из 4 субъединиц.Cytoplasm – цитоплазма; endoplasmic reticulum – эндоплазматический ретикулум; lumen –полость эндоплазматического ретикулума.2.1.3.
Депо-зависимый вход Са2+ в клеткуВ настоящее время считается, что основным механизмом входа Са2+ в невозбудимыеклетки является депо-зависимый (store-operated, store-mediated) или «емкостной» (capacitative)вход Са2+. «Емкостная» модель входа Са2+ в клетки была впервые предложена Джеймсом Патнина основании исследования процессов Са2+-сигнализации в невозбудимых клетках экзокринныхжелёз (ацинарных клетках околоушной слюнной железы крысы) и других эпителиальныхклетках (Putney, 1986).21В соответствии с емкостной моделью, вход Са2+ активируется при опустошении IP3чувствительных Са2+-депо: сигнал об опустошении депо передаётся к плазмалемме, ипроисходит вход Са2+ в клетку по депо-зависимым Са2+-каналам (store-operated channels, SOC)(рис.
3) (Putney, 1986; Putney et al., 2001).Емкостной вход Са2+ стимулируется различными фармакологическими агентами, общимсвойством которых является способность вызывать высвобождение Са2+ из депо. Удобнымиинструментами для прямого исследования емкостного входа Са2+ оказались специфическиеингибиторы Са2+-АТФаз SERCA, обеспечивающих аккумуляцию Са2+ в ЭР или СР (Крутецкаяи др., 2003).
К таким ингибиторам относятся три структурно-различных соединения:тапсигаргин (сесквитерпеновый лактон из растения Thapsia garganica) (Thastrup et al., 1990;Mason et al., 1991), циклопьязониковая кислота (токсичный вторичный метаболит грибов) исинтетический агент 2,5-ди-(трет-бутил)-1,4-бензогидрохинон (DBHQ) (рис. 5) (Mason et al.,1991). Показано, что при ингибировании SERCA происходит пассивная мобилизация Са2+ издепо независимо от активации рецепторов и генерации инозитолфосфатов (Thastrup et al., 1990).2+Рис. 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
