Диссертация (1145903), страница 7
Текст из файла (страница 7)
9. Структура и топология в мембране TRP-каналов (по Song et al., 2011)а - Белки TRPC1, TRPV1, TRPM7 и TRPP (PKD2) – представители разных семейств TRPсуперсемейства – содержат 6 трансмембранных сегментов, причём 5-й и 6-й сегменты илежащий между ними Р-участок (Р) принимают участие в формировании поры. N-конец белкаTRPC1 включает суперспиральный участок (coiled-coil, CC) и много анкириновых повторов (А).На С-конце белка TRPC1 располагается консервативный TRP-домен («TRP» box) и домен,связывающийся с кавеолином (caveolin scaffold domain, CSD). N-конец белка TRPV1 такжесодержит анкириновые повторы, а С-конец белка TRPM7 – киназный домен (Kinase domain).B - Функциональные TRP-каналы могут представлять собой как гетеро-, так игомотетрамеры.Однако были обнаружены и другие молекулярные участники депо-зависимого входаСа2+.
В 2005 г. в результате скрининга генома с помощью малых интерферирующих РНК (small32interference RNA, siRNA), или RNAi-скрининга, в клетках млекопитающих и клетках S2Drosophila был обнаружен белок, участвующий в регуляции SOCE, который получил названиеSTIM (stromal interaction molecule, молекула стромального взаимодействия) (Liou et al., 2005;Roos et al., 2005). Было установлено, что клетки млекопитающих содержат два родственныхгена STIM1 и STIM2. Большая часть STIM1 локализована в ЭР, хотя некоторое количестворасполагается в плазмалемме (Liou et al., 2005; Roos et al., 2005). Белки семейства STIMвключают цитоплазматический С-концевой участок, 1 трансмембранный домен и N-концевойучасток, обращённый в просвет ЭР.
Последний содержит домен «EF-hand», связывающий ионыСа2+ в полости ЭР (рис. 10а) (Liou et al., 2005; Roos et al., 2005). Опустошение Са2+-депоприводит к отсоединению Са2+ от домена «EF-hand» белка STIM1. При этом происходитолигомеризация STIM1, в которой ключевую роль играет домен SAM (SAM – sterile alpha motif)(рис. 10а), и транслокация олигомеров в области контакта ЭР и плазмалеммы, где STIM1активируют CRAC-каналы (Liou et al., 2005; Roos et al., 2005).
Таким образом, белки STIM, содной стороны, играют роль Са2+-сенсоров в мембране Са2+-депо, а с другой – передаютинформацию об опустошении депо к плазмалемме и активируют емкостной вход Са2+ (Liou etal., 2005; Roos et al., 2005).Кроме того, RNAi-скрининг геномов Drosophila и млекопитающих позволил установитьбелок, который участвует в формировании поры депо-зависимого Са2+-канала, - Orai/CRACM(Orai – от названия хранителей небесных врат в греческой мифологии; CRACM - calciumrelease-activated calcium modulator) (Vig et al., 2006; Zhang et al., 2006). Значительный вклад воткрытиебелковкомбинированногоOraiвнеслиисследованияиммунодефицита(severeпациентовcombinedссиндромомimmunodeficiency,тяжёлогоSCID)–наследственного заболевания, связанного с нарушением функции депо-зависимого входа Са2+ вТ-лимфоцитах (Feske et al., 2006).В клетках млекопитающих экспрессируются 3 гомологичных гена Orai (Orai1 – 3) (Lis etal., 2007).
Белок Orai1 включает 4 трансмембранных сегмента и функционирует в качествепорообразующей субъединицы CRAC-канала (рис. 10б).33Рис. 10. Структура новых молекулярных участников депо-зависимого входа Са2+(по Prakriya, 2013)а – Основные функциональные домены белка STIM1. Белок STIM1 включает Nконцевой участок, трансмембранный домен (TM, transmembrane) и цитоплазматический Сконцевой участок. N-концевой участок STIM1 содержит сигнальный пептидный участок (Sig);домен «EF-рука» (EF-hand) и стерильный α-мотив (SAM – sterile alpha motif). В составцитоплазматическогоС-концевогоучасткаSTIM1входятсуперспиральныецитоплазматические домены 1 – 3 (CC1 – СС3, coiled-coil domains 1 – 3); домен активации депозависимого входа Са2+ (САD – CRAC activation domain), который включает домены СС2 и СС3;домен инактивации STIM (IDSTIM, STIM inactivation domain); домен, содержащий многоостатков серина или пролина (S/P); домен, содержащий много остатков лизина (K-rich).Арабские цифры указывают номера аминокислотных остатков в аминокислотной цепи белка.б – Топология в мембране белка Orai1.
Белок Orai1 содержит 4 трансмембранных домена(ТМ1 – ТМ4). N- и С-концевые участки Orai1 обращены в цитозоль и включают домены,взаимодействующие с доменами CAD белков STIM1 (CAD-binding domains, розовый).Арабские цифры указывают номера аминокислотных остатков в аминокислотной цепи белка.R91 (аргинин-91), V102 (валин-102), E106 (глутамат-106), D110 (аспартат-110), D112(аспартат-112), D114 (аспартат-114), L273 (лейцин-273), L276 (лейцин-276) – ключевыеаминокислотные остатки белка Orai1, замены которых приводят к потере функции SOCE.Замена аргинина-91 на триптофан (R91W) приводит к развитию у человека синдрома тяжёлогокомбинированного иммунодефицита (severe combined immunodeficiency, SCID).
Глутамат-106участвует в образовании селективного фильтра канала.34Функциональная пора активного канала может представлять собой гомотетрамер Orai1или гетеротетрамер, образованный с участием Orai2 и Orai3 (Lis et al., 2007; Prakriya, 2013). В тоже время стехиометрия комплексов Orai в покоящихся клетках до конца не выяснена.Существуют экспериментальные доказательства того, что в покое (в отсутствие контактов сбелками STIM1) белки Orai могут формировать в мембране димеры или гексамеры (Prakriya,2013).При совместной экспрессии со STIM1 белки Orai1 формируют функционально активныедепо-зависимые Са2+-каналы (Lis et al., 2007).
Предложена следующая модель взаимодействиябелков STIM и Orai. Выброс Са2+ из ЭР приводит к изменению конформации STIM1 и ихолигомеризации (Feske, 2010). Олигомеры STIM1 транслоцируются в область контактов ЭР сплазмалеммой, где STIM1 аккумулируются и образуют кластеры («puncta», или точечныескопления; от лат. «punctus» - точка) (Feske, 2010). В область формирования кластеров STIM1перемещаются также белки Orai1, после чего происходит белок-белковое взаимодействиеSTIM1 и Orai1 и активация депо-зависимого входа Са2+ (Feske, 2010). Показано, что всвязывании этих белков принимают участие суперспирализованный С-концевой домен белкаSTIM CAD/SOAR (CAD – CRAC activation domain; SOAR - STIM – Orai activating region), атакже N- и С-концевые участки Orai1, содержащие CAD-связывающие домены (рис. 10а,б)(Prakriya, 2013).Вероятно, депо-зависимый вход Са2+ может активироваться также в результатевзаимодействия Orai1 и STIM1 с TRP-белками (Liao et al., 2007; Cheng et al., 2013).
По даннымцелого ряда исследований, белки STIM1 регулируют активность депо-зависимых каналов,образованных не только белками Orai1, но и белками TRPС (рис. 11). С другой стороны,активация TRPС с участием STIM1 требует активации белков Orai1 (Cheng et al., 2013). Такимобразом, депо-зависимый вход Са2+, по-видимому, представляет собой комплексный процесс,состоящий из последовательных этапов и скоординированный за счёт белков различныхвнутриклеточных компартментов.35Рис.
11. Модель взаимодействия белков STIM1, Orai1 и TRPC при запуске иподдержании депо-зависимого входа Са2+ в клетки (по Cheng et al., 2013)После опустошения внутриклеточных Са2+-депо происходит агрегация белков STIM1 вмембране депо (эндоплазматический ретикулум, ER - endoplasmic reticulum) и их транслокацияв области тесного контакта депо и плазмалеммы (РМ – plasma membrane). STIM1 активируютдепо-зависимый вход Са2+ с участием белков Orai1. Увеличение внутриклеточнойконцентрации Са2+ вследствие входа Са2+ из наружной среды, в свою очередь, запускаеттранспорт и встраивание в плазмалемму везикул, содержащих гомо- или гетеротетрамерныеканалы TRPC (например, TRPC1/ TRPC3 или TRPC1/ TRPC4).
Эти каналы также активируютсябелками STIM1 и принимают участие в депо-зависимом входе Са2+. Кроме того, вход Са2+ поканалам Orai1 может непосредственно активировать каналы TRPC (например, TRPC5).362.2. Арахидоновая кислота и продукты её метаболизмаАрахидоновая (эйкозатетраеновая) кислота (АК) – полиненасыщенная жирная кислота,молекула которой содержит 20 атомов углерода и 4 сопряжённые двойные связи (20:4, ω6) (рис.12) (Irvine, 1982). Она представляет собой основной компонент глицерофосфолипидов клеточныхмембран (фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина).В глицерофосфолипидах клеток млекопитающих АК занимает преимущественно положение sn2 (Irvine, 1982).АК высвобождается из мембранных фосфолипидов в ответ на рецептор-зависимую илирецептор-независимую стимуляцию различных типов клеток (Irvine, 1982; Needleman et al.,1986).
Так, на резидентных перитонеальных макрофагах мыши было показано, что образованиесвободной АК усиливается при воздействии физиологических агонистов зимозана иконканавалина А, а также кальциевого ионофора А23187 или активатора ПКС форболовогоэфира РМА (Balsinde et al., 1990).Известны разнообразные механизмы высвобождения АК (Irvine, 1982; Needleman et al.,1986).1) Прямое высвобождение АК происходит под действием фосфолипазы А2 (ФЛА2),которая катализирует расщепление сложноэфирной связи между АК и глицерофосфолипидом вположении sn-2.
При этом образуется свободная АК и лизофосфолипиды (Irvine, 1982).2) Фосфолипазы С (ФЛС) расщепляют мембранные фосфолипиды с образованием ДАГ(Dieter, Fitzke, 1993). АК высвобождается из ДАГ под действием диацилглицероллипазы (ДАГлипазы).3) При действии на фосфолипиды (преимущественно фосфатидилхолин) фосфолипазы Dобразуетсяфосфатиднаякислота.Далеефосфатиднаякислотадефосфорилируетсяфосфогидралазой с образованием ДАГ, из которого АК высвобождается с участием ДАГлипазы (Dieter, Fitzke, 1993).Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
