Автореферат (1145738), страница 2
Текст из файла (страница 2)
По теме диссертации опубликовано 7 работ. Из них 3 статьи в журналах изсписка, рекомендованного ВАК, в том числе 3 на английском языке в журналах WOS.Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителюА. В. Смирнову, А. А. Добровольскому, А. П. Мыльникову и всему коллективу кафедрызоологии беспозвоночных за неоценимую помощь в подготовке работы. Отдельная6благодарность А.
А. Глотовой, Ф. Е. Четверикову и Т. Чужековой за предоставленные пробы изудалённыхместообитаний.ресурсныхцентров«КультивированиеИсследованияСПбГУпроведены с использованием оборудования«Развитиемикроорганизмов»,молекулярных«Вычислительныеиклеточныхтехнологии»технологий»,атакже«Междисциплинарного ресурсного Центра по направлению Нанотехнологии» при поддержкепроекта РФФИ № 12-04-31982-мол_а, а также грантов Санкт-Петербургского университета.Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, трёх глав («Обзорлитературы», «Материал и методы», «Результаты и Обсуждение»), заключения и спискалитературы. Основное содержание, изложенное на 138 страницах, содержит 3 таблицы. Списоклитературы содержит 99 источников, из них 89 на иностранных языках.Глава 1. Обзор литературыВ данной главе приведена общая характеристика центрохелидных солнечников иобобщена известная информация об особенностях строения клетки, о покровных структурахпредставителей этой группы протистов и взглядах на эволюцию этих структур.
В краткомсистематическом обзоре рассмотрены основные таксоны, выделяемые в составе группы нанастоящий момент, по каждой группе приведены иллюстративный материал, краткое описаниеее особенностей и систематические диагнозы.Глава 2. Материал и методыМатериалом для исследования послужили пробы, отобранные автором в ходе егомноголетней работы на внутренних озёрах Валаамского архипелага и других водоёмах Северозапада России (40 проб), а также пробы из различных пресноводных местообитаний Дании (13проб), Швейцарии (15 проб), Крайнего севера России (1 проба), Дальнего Востока России (15проб), а также Южной Африки (13 проб), имевшиеся в распоряжении группы протистологиикафедры зоологии беспозвоночных СПбГУ.Пробы высевали в чашки Петри и инкубировали в лаборатории, получая накопительныекультуры. Затем солнечников, которые представляли интерес с точки зрения задачисследования, выделяли в клональную культуру.
Всего в ходе работы было высеяно 97 проб, изкоторых в 30 были найдены солнечники. Из них 19 штаммов были выделены в чистуюклональную культуру, два из них на настоящий момент депонированы в Коллекции КультурВодорослей и Простейших (CCAP, Institute of Freshwater Ecology, England). Ещё 5 штаммовбыли исследованы в накопительных культурах. При длительном хранении штаммыподдерживали при температуре +4 ºC, закрыв чашки лабораторной лентой Parafilm M (SigmaAldrich).Для наблюдения и фотографирования солнечников в чашках Петри использовалиинвертированные микроскопы Nikon Eclipse TS100 и Leica DMI 3000B, снабжённые фазово-7контрастной оптикой и оснащенные цифровой камерой Nikon DS-Fi1. Для изучения насветовом уровне или в сканирующем электронном микроскопе клетки высушивали напокровных стёклах (Zeiss Supra 40 VP, Zeiss Merlin и Tescan Mira3 LMU) или на медныхблендах с формваровой подложкой для изучения в просвечивающем электронном микроскопе(Jeol JEM-1400 и Jeol JEM-2100HC).
Чтобы избежать сигнала от кремния, содержащегося встекле для энергодисперсионного рентгеновского анализа (Oxford Instruments INCAx) клеткивысушивали на канцелярском скотче.Геномная ДНК была изолирована из клеток с помощью гуанидин-изотиоцианатногометода (Maniatis et al. 1983). Ген малой субъединицы рРНК амплифицировали сиспользованием пары концевых праймеров Thx25F — Helio1979R, ампликоны подвергалипрямому секвенированию или клонировали при помощи вектора pТZ57R/T (Thermo ScientificInsTAclone PCR Cloning Kit#K1213, #K1214) в бактериях Escherichia coli (штамм JM107).АмпликонысеквенировалииспользуясеквенаторыABI Prism 310илиABI Prism 3500 xl (Applied Biosystems, USA); полученные последовательности выравниваливручнуюприпомощипрограммыSeaView(Galtier,Gouy,1996).Реконструкциюфилогенетических деревьев на основе набора выровненных последовательностей проводилипри помощи программ PhyML (Guindon, Gascuel, 2003) и MrBayes (Huelsenbeck, Ronquist, 2001).Глава 3.
Результаты и обсуждениеИзучение цистных чешуек Raineriophrys erinaceoides и Raphidiophrys heterophryoidea.В ходе нашего исследования на примере двух видов Raineriophrys erinaceoides и Raphidiophrysheterophryoidea удалось показать, что в пределах одной клональной культуры солнечники могутиметь различные, существенно отличающиеся наборы чешуек. Это связано с тем, что уэксцистировавшихся особей в покровах некоторое время продолжают персистировать цистныечешуйки.Эксцистировавшихся индивидуумов (рис. 1В) можно было наблюдать в более старыхкультурах и, помимо цистных чешуек, присутствующих наряду с обычными чешуйкамитрофической стадии (рис. 1А), каких-либо отличий от прочих трофозоитов выявлено не было.Были получены субклоны эксцистировавшихся индивидуумов R.
heterophryoidea, и клетки вкультурах имели только чешуйки трофической стадии.Идентификация и разделение видов у центрохелид ведётся на основании морфологиичешуек. Некоторые авторы определяют солнечников и/или описывают виды на основанииотдельных чешуек, найденных в пробах (Wujek, 2003; Esteban et al., 2012). Находка цистнойчешуйки, имеющей совершенно необычную морфологию, заставит в такой ситуации думать,что мы имеем дело с новым видом и не позволит корректно идентифицировать организм.Именно поэтому точное описание всех типов чешуек, включая цистные чрезвычайно8желательно для каждого вида центрохелидных солнечников.
Этот пример показывает, чточешуйки трофических стадий в некоторых случаях могут не являться единственным идостаточным признаком для описания и идентификации видов.Сравнение ко-специфичных штаммов из удалённых местообитаний. Сравнение коспецифичных штаммов из разных местообитаний было проведено на примере двух видов:Acanthocystis nichollsi и Acanthocystis takahashii. В случае A. nichollsi были изучены 4 штамма –из оз.
Игуменское – Валаамский архипелаг, Северо-запад России; из реки Лягэдей-Яха – ЯмалоНенецкий а. о., Крайний север России; из оз. Гурре – Дания и из горного ручья вВосточно-Капской провинцииЮАР. Также, нами были изучены2 штамма Acanthocystis takahashiiиз оз. Лещовое – Валаамскийархипелаг, Северо-запад России ир. Амур - Дальний Восток России.Морфологические иморфометрическиехарактеристики как трофозоитов,так и чешуек изученных штаммовсовпадали с параметрами воригинальных описаниях (Nicholls,1983; Dürschmidt, 1987), чтоРис. 1. Raphidiophrys heterophryoidea Zlatogursky, 2012, оз.Никоновское, Валаамский архипелаг. А.
Высушенныйпрепарат чешуек трофической стадии. СЭМ. Б.Энергодисперсионный рентгеновский анализ. Картараспределения кремния. Белые точки отвечают пикамкремния. В. Эксцистировавшийся организм подпокровным стеклом, Г. Цистная чешуйка. СЭМ.Масштабная черта: А., Б. – 1 мкм, В. – 10 мкм, Г – 2 мкм.говорит о ко-специфичностиизученных штаммов в рамкахсуществующей морфологическойконцепции вида у центрохелидныхсолнечников.Молекулярно-филогенетический анализ подтвердил близкое родство ко-специфичных штаммов из различныхместообитаний (рис. 2). Как Acanthocystis nichollsi, так и Acanthocystis takahashii сформировалина дереве хорошо поддержанные клады.
В кладу Acanthocystis nichollsi также попал сиквенсAY749632, идентифицированный как Acanthocystis nichollsi из Великобритании (Cavalier-Smith,von der Heyden, 2007). К кладе Acanthocystis takahashii сестринское положение занимает неидентифицированный сиквенс AY749628 из Новой Зеландии, что может говорить о том, что этоещё один, третий сиквенс Acanthocystis takahashii. Сравнение молекулярных данных поштаммам ко-специфичным согласно морфологической концепции показала, что оба метода9выявляют одни и те же совокупности. Таким образом если сравнить между собой именночешуйки трофической стадии, то описание и идентификация видов может осуществляться наоснове морфологии покровных структур.Рис. 2. Фрагмент байесовского дерева на основе сиквенсов гена 18S рРНК (GTR-модель, 1569позиций) для 121 таксона центрохелидных солнечников, а также 32 близких внешних групп.Новые сиквенсы выделены жирным шрифтом.
Поддержка: слева – постериорная вероятность,справа – значение бутстрапа при анализе методом максимального правдоподобия, если кладаотсутствовала при этом анализе, справа стоит знак «-». Молекулярные клоны обозначеныпометкой «Клон» с порядковым номером, остальные сиквенсы были получены прямымсеквенированием ПЦР-продукта. Полное дерево представлено в тексте работы.Сравнение симбионт-содержащих штаммов солнечников с бесцветными(Acanthocystis penardi Wailes, 1925; Acanthocystis turfacea Carter, 1863).
Представители двухвидов ― Acanthocystis turfacea и Acanthocystis penardi являются одними из широкораспространённых солнечников. Благодаря своим крупным размерам они часто отмечаютсяисследователями (Nicholls, 1983). В оригинальных описаниях обоих видов и последующихнаходках часто указывается наличие в цитоплазме солнечников симбиотических хлорелл(Carter, 1863; Wailes, 1925; Siemensma, 1991). Однако были отмечены и находки бесцветныхсолнечников, которые имели сходную морфологию чешуек, но меньшие размеры (Rainer, 1968).По нашим данным, симбионтсодержащие клетки Acanthocystis penardi имеют большийдиаметр клетки и более крупные чешуйки и чешуек. Аналогичная закономерность выявляетсяпри сравнении наших данных по бесцветным Acanthocystis turfacea с литературными посимбионтсодержащим Acanthocystis turfacea (Rainer, 1968).
Данный результат может говоритьлибо о том, что формы с симбионтами представляют собой самостоятельные виды (подобноParamecium bursaria среди инфузорий) либо о том, что захват хлорелл у этих двух видов10происходит факультативно и вызывает увеличение как диаметра клетки, так и размеровпокровных структур.Статус Acanthocystis trifurca Nicholls, 1983 и A. myriospina Penard, 1890. В ходе работыбыл реизолирован и изучен солнечник Acanthocystis trifurca.
Синонимизация этого названия сназванием A. myriospina Penard, 1890, сделанная Дюршмит (Dürrschmidt, 1985) не кажется намобоснованной. При сравнении данных Николса и оригинального описания Пенара налицоявные отличия солнечников по диаметру клетки, а также по длине радиальных чешуек. Нашвывод подтверждается результатами молекулярно-филогенетического анализа. Намолекулярных деревьях A.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
