Автореферат (1144822), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Вработеудалосьобнаружитьнесколькогенов,контролирующихфункционирование МХ у C. reinhardtii: CHLH, LTS3, SUP3, SUP-1 и Mod-u-25.Структурный ген CHLH (первоначально – CHL1), оказался геном большой Hсубъединицы МХ. Продукты остальных генов регулируют активность этогофермента. Ген LTS3 кодирует фактор транскрипционной регуляции – активаторгенов МХ в темноте. Продукт гена SUP-I, по-видимому, вместе с факторомLTS3 входит в состав регуляторной системы, координирующей работу МХ.Белок, кодируемый геном SUP-3, в норме подавляет иной путь активации МХ ухламидомонады. Таким образом, помимо ПОР, у C. reinhardtii первыйспецифический фермент биосинтеза Хл– МХ оказался важнейшимкомпонентом системы регуляции темновых процессов хлорофиллобразования.Нам удалось обнаружить два пути активации МХ в темноте.
В первом путизадействованы факторы транскрипционной регуляции LTS3 и SUP-I. В случаеего блокирования, возможно переключение на альтернативный путь, в нормерепрессированный продуктом гена SUP3. Получение мутантов-продуцентовПП привело к обнаружению нового механизма ретроградной (из хлоропласта вядро)регуляции,препятствующегонакоплениюэтогосильногофотосенсибилизатора, разрушающего клетки C.
reinhardtii в условиях29освещения. Его контролирует ген хлоропласта, названный Mod-u-25, −негативный регулятор синтеза АЛК. Молекулярную природу гена Mod-u-25еще предстоит выяснить. Полученные результаты позволяют говорить осуществовании в системе регуляции биосинтеза Хл у хламидомонадырегуляторного контура, координирующего работу двух ферментативныхкомплексов – МХ и синтеза АЛК (рис. 22).
В отличие от известногопосттрансляционного механизма обратного ингибирования (feedback) АЛКгемом и Пд, он, по-видимому, представляет собой систему «feedforward»,Рисунок 20. Факторы регуляции синтеза Хл у C. reinhardtii. Пострансляционносинтез АЛК репрессируют (стрелки): протохлорофиллид, связываясь с белком FLU, игем, взаимодействуя с ферментом глутамил-тРНК редуктазой (GluTR).
Белок Gun4связывает магний-хелатазу (МХ) с мембранами хлоропласта, активируя фермент.Новые факторы регуляции, обнаруженные в работе: темновой биосинтез Хлобеспечивается путем транскрипционной регуляции генов, кодирующих МХ и АЛКкомплекс. Фактор LTS3 активирует их транскрипцию; фактор SUP-3 репрессируетМХ; фактор SUP-I – активатор транскрипции гена LTS3; Mod-u-25 – репрессорсинтеза АЛК и МХ. Гены, обнаруженные в работе, – в прямоугольниках.
Контур –область feedforward-транскрипционной регуляции30котораяобеспечиваетодновременную«настройку»работыэтихдвухферментных комплексов. На посттрансляционном уровне модулятором этогоконтура может служить белок Gun4, а транскрипционная активация геновобоих ферментных комплексов осуществляется продуктами генов LTS3 и SUPI, описанных в работе. Фундаментальные исследования, представленные вработе, имеют практическую значимость. Мутанты C. reinhardtii, дефектные погену CHLH с нарушенной регуляцией биосинтеза Хл, послужили основойсоздания штаммов-продуцентов ПП [Авторские свидетельства: № 1369275 (1988);№ 1759230 (1989)]. Его уникальные фотохимические свойства состоят вспособности поглощать световую энергию. ПП – сильный фотосенсибилизатор,– на свету он генерирует активные формы кислорода, которые запускаютпроцессы разрушения липидов клеточных мембран.
Пигмент флуоресцирует вкрасной области спектра (λ=606 нм и 604 нм при возбуждении светом с длинойволны 405 нм) и способен накапливаться в пролиферирующих тканях. Этопозволяетиспользоватьеговцеляхфлуоресцентнойдиагностикиканцерогенеза и при фотодинамической терапии, – накопленный в тканях ППпри освещении вызывает быструю деструкцию окружающих тканей. Еще одна,новая область применения ПП связана с нанотехнологиями – созданиемпорфирин-содержащихполимеров–основныхкомпонентовсенсоров,способных выявлять широкий спектр токсичных элементов в окружающейсреде [Asano T. et al., 2010].
Перспективными являются работы по созданиюэнергопреобразующих структур на основе ПП. В этих трехкомпонентныхсистемах (безметалльный порфирин – Zn порфирин – хинон) может бытьосуществленапоследовательностьсобытий,реализуемыхвфотосинтезирующих организмах: поглощение света → миграция энергии →разделение зарядов. Такие синтетические структуры могут стать прообразомискусственных энергопреобразующих устройств будущего.
Таким образом,перспективы применения ПП (как в фундаментальном, так и в прикладномаспекте) связаны с возможностью создания гибридных наноразмерных31биоэнергетических и биосенсорных устройств. Результаты работы могут бытьиспользованы при подготовке материалов по новым курсам лекций «Генетикафотосинтеза» и «Генетика микроводорослей», на кафедре генетики ибиотехнологии СПбГУ, и аналогичных курсов в других университетах России.Основные научные результаты работы1.
Идентифицировано два ядерных гена Chlamydomonas (С.) reinhardtii: CHLH иLTS3, рецессивные мутации в которых блокируют биосинтез Хл, приводя кнакоплению его интермедиата протопорфирина IX в темноте. Мутанты по генуCHLH светочувствительны, а LTS3-мутанты способны зеленеть на свету.2. Впервые у водорослей клонирован и секвенирован ядерный ген CHLH C.reinhardtii, кодирующий H-субъединицу МХ. Охарактеризованы его структураи функции, идентифицированы мутантные аллели.3.
Осуществлено позиционное клонирование гена LTS3 C. reinhardtii. Онкодирует фактор транскрипции семейства GATA, который активируетэкспрессию генов ферментов биосинтеза Хл – МХ и АЛК-синтезирующегокомплекса в гетеротрофных условиях.4. Результатом исследования супрессии мутаций в гене LTS3 сталообнаружение двух новых ядерных генов SUP-3 и SUP-I C. reinhardtii,кодирующих факторы регуляции активности МХ. Продукт SUP-I, вместе сLTS3 задействован в транскрипционной активации темнового биосинтеза Хл инеобходим для зеленения.
Ген SUP-3 контролирует альтернативный LTS3-путимеханизм регуляции.5. Обнаружена новая хлоропластная мутация mod-u-25, которая приводит ксверхпродукции по ПП в клетках двойных мутантов C. reinhardtii генотипа:chl1,mod-u-25 за счет усиления синтеза АЛК. Эффект мутации состоит вотсутствии темновой репрессии транскрипции генов: CHLH, GTR и CABII,кодирующих белки МХ, АЛК-синтезирующего комплекса и светособирающегокомплекса ФС2, соответственно. Продукт гена Mod-u-25 является новым32хлоропластным детерминантом, задействованным в передаче сигнала изхлоропласта в ядро.СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Nikoulina K. Induction and analysis of reversions from various cbn1-mutants lakingchlorophyll b and neoxanthin in Chlamydomonas reinhardtii / K. Nikoulina, E.
Chekunova// Photosynthesis research. ‒ 1992 ‒ V.34 ‒ № 1 ‒ P. 186. ISBN: 0-7923-2090-5.2. Чекунова Е.М. Регуляция биосинтеза предшественников хлорофилла в мутантахзеленой водоросли Сhlamydomonas reinhardtii / Е.М. Чекунова, Н.В. Шалыго, Е.Б.Яронская, Аверина Н.Г., Чунаев А.С. // Биохимия. ‒ 1993. ‒ Т. 58. ‒ № 9. ‒ С. 14301436.3. Чунаев А.С. Генетический контроль биосинтеза хлоропластных пигментов узеленых водорослей / А.С.
Чунаев, А.В. Столбова, К.В. Квитко, Н.Н. Александрова,Е.М. Чекунова и др // Генетика ‒ 1994 ‒Т. 30 ‒ № 8. ‒ С.1075-1084.4. Chekunova E.M. Regulatory mutation affecting chlorophyll biosynthesis inСhlamydomonas reinhardtii E.M. Chekunova, E.B. Yaronskaya, N.V. Shalygo, N. G.Averina., A.S. Chunaev / Photosynthesis: from light to Biospere; ed.: P.
Mathis / Dordrecht:Klawer AP, 1995. ‒ V. 3. ‒ P. 921-924. ISBN: 0-7923-3859-6.5. Ermilova E.V. Isolation and characterization of chemotaxis mutants of Сhlamydomonasreinhardtii / E.V. Ermilova , E.M. Chekunova, Zh. M. Zalutskaya, K.R Krupnov, B.V.Gromov // Current Microbiology. ‒ 1996. ‒ V. 32. ‒ P. 357- 359.6.
Никулина К.В. Генетический анализ ревертантов от мутантов, лишенныххлорофилла b у Chlamydomonas reinhardtii / К.В. Никулина, Е.М. Чекунова, B.Рюдигер, А.С. Чунаев // Генетика. ‒ 1997. ‒ Т. 33. ‒ № 5. ‒ С. 577-582.7. Chekunova E.M. Molecular characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutantsdefective in H subunit of Magnesium chelatase / E.M. Chekunova, Y. Papenbrock, V.Voronetskaya, B.
Grimm, C.F. Beck // Mol.Gen.Genet. ‒ 2001. ‒ V. 266. ‒ P. 363-373.8.СавельеваН.В.СупрессиямутацийвгенеLTS3,контролирующемсветонезависимый синтез хлорофилла у Chlamydomonas reinhardtii / Н.В. Савельева,Е.М. Чекунова // Вестник С.-Петербургского университета ‒ 2005. ‒ Сер. 3. ‒ Вып.
2.‒ № 11. ‒ С. 24-32.9. Чекунова Е.М. Ген LTS3 контролирует светонезависимый биосинтез хлорофилла у33зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii / Е.М. Чекунова, Н.В. Савельева //Экологическая генетика. ‒ 2010. ‒ № 2. ‒ С. 35-44.10. Чекунова Е.М. Генетика биосинтеза хлорофилла: Темновой и светонезависимыйпути / Е.М. Чекунова // Экологическая генетика. ‒ 2010. ‒ № 3. ‒ С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
