Автореферат (1144822), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Дляоценки расстояний генов от центромер в скрещивания были вовлеченыштаммы-дисомики. Анеуплоидия ведет себя как центромерный маркер, чтопозволяет рассчитывать частоту расщепления во втором делении мейоза (fII),равную частоте тетратипов (Т) в сочетании исследуемого маркера ианеуплоидии (n+1) среди тетрад диплоида-трисомика [Горденин, 1978].Расщепления по or13/n+1 (6P:11N:26T) означало, что расстояние генцентромер, определяемое как 0,5 f(Т), для гена LTS3 – 30 сМ. Для гена CHL1 поданным расщепления зигот-трисомиков (++-) оно составило 5,4сМ.
Такимобразом, по результатам генетического анализа, ген LTS3 локализован в группесцепления I C. reinhardtii в 30 сМ от центромеры.Биосинтез Хл – это цепь последовательных ферментативных реакций, идля поиска звена, контролируемого генами CHL1 и LTS3 C. reinhardtii, вклетках мутантов по этим генам определяли содержание Хл и ихпредшественников методами хроматографии (HPLC) и спектроскопии (рис.
4).13ХОМсодержаттолькооднуформубезметальныхпорфиринов–протопорфирин IX (ПП). Светочувствительные мутанты по гену CHL1 втемнотенакапливаюттолькоПП,тогда как зеленеющие на свету клеткимутантов по гену LTS3, содержат и егомагниевые производные (от Мg-ПП доХл). Наличие ПП – субстрата МХ вклетках мутантов по гену CHL1 (табл.2) указывало, что у них биосинтез Хлгенетически заблокирован на этапепревращения ПП.
Слабая активностьэтогоферментапозволилапредположить, что продуктом генаCHL1 является одна из субъединицРисунок. 4. Спектр поглощенияпорфиринов (в диэтиловом эфире) измутанта по гену CHL1 (1,2). Положениямаксимумов соответствуют спектрупоглощения стандартного ПП (3)МХ. Western-blot анализ белков, экстрагированных из штаммов дикого типа C.reinhardtii и ХОМ, с антителами к белкам МХ табака и арабидопсиса, показалотсутствие белка H-субъединицы МХ в мутантах по гену CHL1, и наличиесубъединиц H и I этого фермента у дикого типа и мутантов по гену LTS3.Данные о генетике и биохимии мутантов по гену CHL1 C.
reinhardtiiсвидетельствовали, что он кодирует большую субъединицу H ферментамагний-хелатазы. Этот ген был переименован в CHLH.Таблица 2. Характеристики аппарата биосинтеза хлорофиллаШтаммУсловияростаГенотипСодержаниепигментов*Относительная(%)9(nMol/10 клеток) ©активностьферментов:ППГемХлМХМТ АЛКCC124светwt0,31233800100100100CC124темнотаwt0,17502400637760Chl1темнотаchl130270н187791© - даны средние значения величин, полученных в 3-6 повторностях. Ошибки непревышают 5%. *МХ – магний-хелатаза; МТ - магний-ПП метилтрансфераза: АЛК –АЛК-синтезирующий комплекс; н – не обнаружено.143.2. Молекулярно-генетическая идентификация гена CHLH C.
reinhardtii. Поискгена H-субъединицы МХ (рис. 5) начинали с анализа аминокислотныхпоследовательностей продуктов его генов-ортологов у бактерий Rodobactercapsulatus (BchH) и Synechocystis PCC6803 (chlH), ячменя (ген Xantha-f) ильвиного зева (ген Olive). Было обнаружено 2 консервативных участка белкаCHLHячменя:FGYEGDPM(624-631)иLEFMPGRQ(670-677).Сконструированные на их основе дегенеративные праймеры использовали дляПЦР-амплификации на матрице ДНК из клеток дикого типа C. reinhardtii.Полученный ампликон (162 пн) по результатам секвенирования оказалсяидентичен (100%) гену Xantha-f ячменя.
Этот фрагмент гена H- субъединицыМХ C. reinhardtii послужил зондом при скрининге библиотеки кДНК C.reinhardtii, любезно предоставленной проф. Роше (J.-D. Rochaix, University ofGeneva, Switzerland). В результате были найдены 2 позитивных фаговых клона,имеющих перекрывающиеся фрагменты ДНК гена CHLH размером 1,4 тпн и3,1 тпн. Второй фрагмент содержал сигнал полиаденилирования TGTAA икороткий поли-A хвост. Фрагмент размером 1,4 тпн не включал начала этогогена. Для поиска его 5’-конца, с помощью системы 5’RACE (rapid amplificationcDNA ends) был получен фрагмент, послуживший зондом при скринингегеномной (EMBL3) библиотеки C.
reinhardtii [Goldschmidt-Clermont, 1986].Фаговые ДНК из 3-х позитивных клонов обрабатывали рестриктазами и искалифрагмент, который гибридизовался с RACE-фрагментом, но не с остальнымидвумякДНК-зондами.Онбылнайден(1,75тпн), выделен изагарозногогеляисеквенирован. Областиэкзонов и интронов вРисунок. 5. Клонирование гена CHLH H-субъединицымагний-хелатазы C. reinhardtii – реконструкцияегонуклеотиднойпоследовательности15определяли сравнением с гомологичным ему EST-фрагментом размером 445пн, из EST-библиотеки [Asamizu et al., 1999].
Сопоставляя все полученныефрагменты гена CHLH C. reinhardtii, определили начало кодирующегосиквенса, установили кодон инициации трансляции, и получили полнуюпоследовательность его кДНК (5054 нп). Последовательность ДНК гена CHLHамплифицировали на матрице ДНК штамма дикого типа с использованием 6-типар праймеров, синтезированных по его кДНК, и ДНК-полимеразы Pfu-Turbo(Stratagene). Сравнение геномной и кДНК последовательностей гена CHLHпозволило реконструировать его интрон-экзонную структуру (рис.
6). Онсодержит короткий (25 пн) 5’UTR, ОРС длиной 4186 пн, кодирующую 1399аминокислотных остатков, первые 36 из которых принадлежат хлоропластномутранзитному пептиду, и длинный (827 пн) 3’-нетранслируемый конец.Нуклеотидные последовательности кДНК и геномной ДНК гена CHLHбольшой субъединицы магний-хелатазы C. reinhardtii, депонированы в базеданных EMBL: AJ307054 (CHLH сDNA) и AJ307055 (CHLH gene). Копийностьгена СHLH проверяли методом блот-гибридизации по Саузерну (рис.
7).Рисунок 6. Структура гена CHLH хламидомонады (7035 пн). Темные области экзоны, белые – интроны. 5’UTR и 3’UTR – в виде узких прямоугольников.Стрелки указывают положения инициирующего кодона (ATG), стоп-кодона (TAA),сигнала полиаденилирования (TGTAA) и мутаций (+1 frameshift) chl1 и brs-1Рисунок 7. Анализ ДНК C.
reinhardtii по Саузерну. 800 нггеномной ДНК штамма СС124, порезанной рестриктазами,не имеющими сайтов узнавания в гене СHLH, или этот сайтрасположен на его концевом участке: Sal1 – дорожка 1;HindIII – 2; BamH1 – 3; SmaI – 4, были фракционированы вагарозном геле и перенесены на мембрану. Для гибридизациииспользовали фрагменты кДНК гена CHLH C. reinhardtii16Единичные сигналы гибридизации говорят о наличии только одной копии этогогенавгеномеC.reinhardtii.МутантныеаллелигенаCHLHбылиамплифицированы на матрицах ДНК мутантных штаммов, с использованием 6ти пар ранее созданных праймеров, и Pfu-Turbo-ДНК-полимеразы (Stratagene).Мутации chl1 и brs-1гена CHLH оказались однонуклеотидными вставками (рис.6), ведущими к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодонов через 22 и164 триплетов нуклеотидов, соответственно.
Генетическую природу мутацийchl1 и brs-1, как дефектов в гене CHLH, подтвердили эксперименты погеномнойкомплементации.Трансформациямутантовпоэтомугенуфрагментами ДНК, содержащими аллель дикого типа гена CHLH, вела кпоявлению зеленых трансформантов. После клонирования гена CHLH былиполучены антитела к белку CHLH C. reinhardtii. Иммуноблотинг (рис. 8)подтвердил отсутствие белка CHLH в клетках мутантов генотипа: chl1 и brs-1.Рисунок 8. Вестерн-блот анализ белков из штаммадикого типа (WT) и мутантов chl1 и brs-1 C. reinhardtii.А. Иммунодетекция белков (10 g) с поликлональнымиантителами (ПКА) к малой CHLI субъединице МХ табака,узнающих, также, белок CHLD. Б.
Темновые культурыклеток WT и мутантов освещали 2 часа и экстрагировали изних белки. Иммуноблоттинг проводили с ПКА для белкаCHLH C. reinhardtii, полученные в ходе работыТранскрипция гена CHLH C. reinhardtii светозависима (рис.
9). Его мРНКдетектируется в обоих мутантных штаммах, и свет, также как и в случае клетокдикого типа, стимулирует ее накопление, свидетельствуя, что, мутации chl1 иbrs-1 не оказывают заметного влияния ни на транскрипцию гена CHLH, ни наеѐ регуляцию светом. Свет активирует экспрессию этого гена на уровнетранскрипции, – накопление белков CHLH в клетках C. reinhardtii отражаетдинамику накопления транскриптов гена CHLH (рис. 10). Белки, ортологичныебелку CHLH C.
reinhardtii, были обнаружены у представителей как про-, так иэукариот. Филогенетический анализ показал, что их общий предшественник –17Рисунок 9. Транскрипция гена CHLH C. reinhardtii.10 g суммарной РНК из штамма WT дикого типа имутантов chl1 и brs-1 ибридизованы по Нозерну сфрагментами кДНК гена CHLH C. reinhardtii.Уровень мРНК определяли в клетках, выращенных втемноте (Т), при перенесении их на свет или напостоянном свету (С). Контроль - пробы ядерногогена RBCS2 малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазыРисунок 10. Вестерн-блот анализ с антителами(ПКА) к белку CHLHC.
reinhardtii. На каждойдорожке – по 20 g белков из темновых культур (Т)дикого типа (WT), и после их переноса на свет.кобальт-хелатаза (CobN) прокариот. В последовательности белка CHLH C.reinhardtii найдено три консервативных остатка гистидина: H664, H668 и H813 –потенциальных сайтов связывания Mg2+ с CHLH при формировании гистидинMg-ПП комплексов.3.3. Идентификация гена LTS3 зеленой водоросли C.reinhardtii. Генетическийконтроль темновых процессов формирования Хл изучали на модели мутантовC. reinhardtii по гену LTS3 – оранжевых в темноте, зеленеющих на свету (рис.1). У фенотипически сходного с ними мутанта yellow Y-7 блокирована реакцияпревращения Пд в Хд, – в темноте их клетки накапливают только Пд (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
