Автореферат (1144822), страница 4
Текст из файла (страница 4)
3).Мутации lts3 и brc-1 в гене LTS3 ведут к накоплению ПП – более раннего, чемПд, интермедиата Хл и небольших количеств его магниевых производных: MgПП, MgППЭ и Пд. На свету мутанты по гену LTS3 синтезируют Хл до уровнятемновых культур дикого типа.
В отличие от содержащих Пд форм yellow(штамм Y-7, рис. 11), у накапливающих ПП мутантов процесс зеленения –индуцированного светом синтеза Хл, происходит с временной задержкой.Учитывая, что время одной генерации штаммов: Y-7, Lts3, и Brc-1 составляет20, 23 и 27 часов, соответственно, видно, что синтез Хл запускается у мутантов18Таблица 3. Содержание Хл и его предшественников в клетках C. reinhardtiiУсловия ГенотипСодержание пигментов (nMol/109клеток)©ШтаммростаПП Mg-ПП MgППЭ ПдХдХлкультурCC124светwt0,190,200,18нн3680Lts3светlts30,410,540,56н89-529* 2450Brc-1светbrc-10,370,670,39н54-385* 2100Y-7светy-70,2нннн3280CC124темнотаwt0,30,200,080,8н2350Lts3темнотаlts312,00,770,62н187Brc-1темнотаBrc-114,00,540,8217,0н85Y-7темнотаyellow-70,43нн42,0нн© - HPLC-анализ, даны средние значения величин из 3-6 повторностей.
Ошибки непревышают 5%. Обозначения: ПП – протопорфирин IX, MgППЭ – монометиловыйэфир магний-ПП, Пд – протохлорофиллид, Хд – хлорофиллид, Хл – хлорофиллы(a+b); н – не регистрируется; * - измерения в условиях переноса культур из темнотына свет, так как при постоянном освещении Пд не накапливается.по гену LTS3 только после деления насвету. По-видимому, свет снимает эффектмутаций, – при освещении мутантныеклетки перестают накапливать ПП иначинают синтезировать Хл.
АктивностьМХ у мутанта Lts3 (табл. 4) подавлена втемноте и восстанавливается на свету доРисунок 11. Накопление Хл вклетках мутантов и дикого типа(CC124) при переносе темновыхкультур на светуровня темновых культур дикого типа.Это означало, что продукт гена LTS3регулирует работу МХ в темноте.Штамм,условияростаГенотипТаблица 4.
Активность ферментов биосинтеза хлорофиллаCC124 (свет)CC124 (темн.)Lts3 (свет)Lts3 (темн.)wtwtlts3lts3Активность ферментов:Mg-хелатазаMg-ПП-метилтрансфераза АЛК9(nМоль/10 кл/час) (%)(%)(% )(kat/g)3,23 ± 0,341003,5 ± 0,111001002,57 ± 0,18792,7 ± 0,0877602,46 ± 0,72763,2 ± 0,0691910,72 ± 0,1223,3 ± 0,0794719Для выяснения влияния мутаций в гене LTS3 на экспрессию генов, кодирующихферменты биосинтеза Хл, изучали их транскрипцию (рис. 12). В отличие отдикого типа, в темновых культурах мутанта Lts3 не детектируютсятранскрипты генов МХ и GSA, а у мутанта yellow их уровень снижен.
Переносна свет клеток дикого типа ведет к активации этих генов через 1,5-2 ч, достигаяза четыре часа максимума. Для мутантов по гену LTS3 характерна задержкаактивации транскрипциисветом.Вкультурахсветовыхуровеньэкспрессииизучаемыхгенов у мутанта сходен стаковым у дикого типа, ипревышает его у генов:GTR, CHLH и CHLD.Рис.
12. Транскрипция генов C. reinhardtii,кодирующих ферменты синтеза АЛК (GTR, GSA,ALAD) и субъединицы магний-хелатазы (CHLH,CHLD и CHLI) у мутантов по темновому синтезу Хл.Аликвоты (10 µg) тотальных РНК из штамма дикоготипа СС124 и мутантов: Lts3 и Y-7 использованы дляНозерн-блот гибридизации с фрагментами кДНК геновинтереса.
Культуры выращивали в темноте (ПТ), насвету (ПС) и в условиях темнота – свет. Контроль пробы к гену Rbcs2 рибулозобифосфаткарбоксилазыСинтез субъединиц МХ:CHLH и CHLI у дикоготипаиотражаетмутантаLts3характернакопления мРНК генов,ихкодирующих(рис.13), свидетельствуя, чтоих экспрессия регулируется на транскрипционном уровне, и продукт гена LTS3необходим для транскрипции генов, кодирующих белки МХ, в темноте.
Такимобразом, мутации в гене LTS3 подавляют темновую транскрипцию генов,кодирующих МХ и фермента GSA из АЛК-синтезирующего комплекса.Рисунок 13. Иммуноблотинг белковCHLH и CHLI магний-хелатазы С.reinhardtii. Клетки штамма СС124 дикоготипа и мутанта Lts3 выращены в темноте(ПТ), при освещении темновых культур ина свету (ПС). Контроль – СRP - пробы кбелку plRpLl рибосом хлоропластов20Поиск гена LTS3 в геноме C. reinhardtii вели методами позиционногоклонирования и геномной комплементации, оптимальными для идентификациикартированных генов (рис.
14) с неизвестными функциями. Метод состоит втрансформации мутантных культур фрагментами геномной ДНК дикого типа всоставе библиотеки BAC-клонов [Rymarquis, 2005]. Результаты локализациигена LTS3 позволили из BAC-библиотеки C. reinhardtii выбрать 25 клонов,перекрывающих суммарно по геномной ДНК областьего вероятнойлокализации (~15сМ). Зеленые в темноте устойчивые к хлорамфениколутрансформанты появлялись только в случаях использования двух BAC-клонов:PTQ9626 и PTQ4402. Их ДНК компенсировали эффект мутантных аллелей генаLTS3 и содержали перекрывающиеся последовательности, свидетельствуя, чтообщий для них обоих участок размером 11,9 тпн, несет аллель дикого типа генаLTS3.
При сопоставлении последовательностей геномной ДНК, мРНК и ESTклонов в составе этого фрагмента обнаружили три ОРС. Повторнаятрансформация ДНК этих клонов, обработанных специфичными для каждойОРС рестриктазами, позволила найти искомый ген (рис. 15). Ген LTS3 (971 пн)содержит два экзона (58 пн и 257 пн) и интрон (156 пн). Его транскрипт (815пн) включает короткий (33 пн) 5’UTR, длинный (467 пн) 3’UTR, и ОРС (315пн), кодирующую белок из 104 аминокислотных остатков. В составе белкаРисунок 14. Генетическое и молекулярное картирование гена LTS3 в группесцепления I и в геноме C. reinhardtii.
Расстояния на генетической карте указаны всантиморганах, положение маркеров на хромосоме I - порядковым номеромнуклеотидов. Область перекрывания ДНК использованных BAC-клонов: 1853 3704 тпн. Положение аллелей дикого типа генов LTS3 и аc115 дано курсивом21LTS3обнаружен ДНК-связывающий цинк-пальцевый домен, типичный дляфакторовтранскрипциисемействаGATA(ФТ)(ZnF_GATA)растительного типа. Секвенированиепоказало, что результатом мутацийРисунок 15.
Структура гена LTS3brc-1 и lts3 в гене LTS3 стало отсутствие ZnF_GATA-структур у виртуальныхмутантных белков, что, по-видимому, привело к их дисфункции. Экспрессиюгена LTS3 изучали методом ОТ-ПЦР (рис. 16) и показали, что в норме (у дикоготипа - wt), она негативно регулируется светом, и позитивно – ацетатом. Впромоторных областях генов, кодирующих МХ и АЛК-комплекс, былиобнаружены цис-элементы GATA, узнаваемые ДНК-связывающими доменамиZnF_GATA (от одного – у ALAD и CHL1, до пяти – у GSA) иG-боксы(CACGTG), существенные для световой регуляции транскрипции (у генов GSA,CHLH и CHLD).
По-видимому, фактор LTS3 активирует транскрипцию геновМХ: CHLH, CHLD, CHLI и гена GSA, кодирующего фермент АЛКсинтезирующего комплекса в темноте, и необходим для их световой индукции.Поиск белков, гомологичных LTS3 (программа BLAST), в базах данных nr (Allnon-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF) показал,что его ортологи встречаются только у эукариот. Их гомология основана насходстве ДНК-связывающих GATA-доменов и позволяет отнести белок LTS3Рисунок 16. Транскрипция гена LTS3.
Уровень транскриптов гена LTS3определяли в клетках штамма дикого типа (wt), и мутантов, выращенных в темноте(Т), на свету (С) и после двух часов освещения (2ч) темновых культур. Контроль –экспрессия гена TUB2. Тотальную РНК обрабатывали ДНК-зой и проводилиобратную транскрипцию РНК-зависимой ДНК полимеразой M-MLV с праймерамиoligo-dT. Полученные кДНК (500 нг) служили матрицами для ПЦР-амплификациитранскриптов гена LTS3 с ген-специфичными праймерами. Ампликоны (10 мкл)визуализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозном геле в буфере TBЕ.Штаммы Brc-8 и Т8-3 описаны ниже (в разделе 3.4)22к семейству ZnF_GATA ФТ. Продукт гена LTS3 хламидомонады – первый,обнаруженный у водорослей ФТ, активирующий экспрессию генов магнийхелатазы в темноте.
Сам факт его существования свидетельствует, чтотемновой биосинтез Хл может обеспечиваться регуляторными элементами,действующими на уровне транскрипции. Таким образом, регуляторный генLTS3 у C. reinhardtii кодирует ФТ семейства ZnF_GATA, который активируеттранскрипцию генов ферментов ранних этапов биосинтеза Хл - магнийхелатазы и АЛК-синтезирующего комплекса в гетеротрофных условиях.3.4. Супрессия мутаций в гене LTS3 C. reinhardtii. Анализ супрессии мутантныхпризнаков – продуктивный подход к поиску альтернативных путей биосинтезапигментов. Предметом исследований механизмов регуляции синтеза Хл у C.reinhardtii стали ревертанты, полученные от пигментных мутантов по генуLTS3, кодирующему фактор транскрипционной регуляции генов ферментовсинтеза Хл: МХ и АЛК-комплекса.
Значительный интерес представлял поискдругихкомпонентовобеспечивающихрегуляторнойтемновоймашиныбиосинтезХлклеткивC.условияхreinhardii,отсутствияфункционального белка LTS3. Для их обнаружения, из клеточной культурымутанта Brc-1 по гену LTS3, был отобран зеленый в темноте спонтанныйревертант Brc-8. Сходный уровень содержания Хл в его темновых и световыхкультурах (табл. 6), свидетельствовал о восстановлении темнового синтеза Хл.Гибридологический анализ позволил ответить на вопрос, наследуется лиспособность штамма Brc-8 зеленеть в темноте. Тетрадный анализ показал, чтопризнак наследуется, и реверсия произошла в результате единичной ядерноймутации sup-3 в гене SUP-3, который сцеплен с геном LTS3 C. reinhardtii.Эффект мутации не аллелоспецифичен, – она супрессирует обе мутантныеаллели гена LTS3.
Мутация sup-3 рецессивна – диплоиды, гетерозиготные поsup-3 на фоне гомозиготы: brc-1/brc-1, формировали оранжевые в темнотеколонии.Наличиемежгеннойсупрессиииотсутствиееѐаллельнойспецифичности свидетельствовало о включении альтернативного механизма23Таблица 6. Содержание пигментов в клетках мутантов по гену LTS3ШтаммУсловияГенотипПигменты (nMol/109клеток)©ППMgПППдХлCC124темнотаwt0,30,200,82480CC124светwt0,190,20н3280Brc-1темнотаbrc-112,300,543,412,9Brc-1светbrc-10,370,67н2420Brc-8светbrc-1,arg7,sup-30,2н2510Brc-8темнотаbrc-1,arg7,sup-3нн14,52320*T-8-3темнотаbr-1,arg7,sup-3,sup-I7,50,353,59,3© - Метод спектрофлуориметрии; даны средние значения величин, полученных в 3-6повторностях. Ошибки не превышают 5%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
