Главная » Просмотр файлов » Автореферат

Автореферат (1144822), страница 4

Файл №1144822 Автореферат (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii) 4 страницаАвтореферат (1144822) страница 42019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

3).Мутации lts3 и brc-1 в гене LTS3 ведут к накоплению ПП – более раннего, чемПд, интермедиата Хл и небольших количеств его магниевых производных: MgПП, MgППЭ и Пд. На свету мутанты по гену LTS3 синтезируют Хл до уровнятемновых культур дикого типа.

В отличие от содержащих Пд форм yellow(штамм Y-7, рис. 11), у накапливающих ПП мутантов процесс зеленения –индуцированного светом синтеза Хл, происходит с временной задержкой.Учитывая, что время одной генерации штаммов: Y-7, Lts3, и Brc-1 составляет20, 23 и 27 часов, соответственно, видно, что синтез Хл запускается у мутантов18Таблица 3. Содержание Хл и его предшественников в клетках C. reinhardtiiУсловия ГенотипСодержание пигментов (nMol/109клеток)©ШтаммростаПП Mg-ПП MgППЭ ПдХдХлкультурCC124светwt0,190,200,18нн3680Lts3светlts30,410,540,56н89-529* 2450Brc-1светbrc-10,370,670,39н54-385* 2100Y-7светy-70,2нннн3280CC124темнотаwt0,30,200,080,8н2350Lts3темнотаlts312,00,770,62н187Brc-1темнотаBrc-114,00,540,8217,0н85Y-7темнотаyellow-70,43нн42,0нн© - HPLC-анализ, даны средние значения величин из 3-6 повторностей.

Ошибки непревышают 5%. Обозначения: ПП – протопорфирин IX, MgППЭ – монометиловыйэфир магний-ПП, Пд – протохлорофиллид, Хд – хлорофиллид, Хл – хлорофиллы(a+b); н – не регистрируется; * - измерения в условиях переноса культур из темнотына свет, так как при постоянном освещении Пд не накапливается.по гену LTS3 только после деления насвету. По-видимому, свет снимает эффектмутаций, – при освещении мутантныеклетки перестают накапливать ПП иначинают синтезировать Хл.

АктивностьМХ у мутанта Lts3 (табл. 4) подавлена втемноте и восстанавливается на свету доРисунок 11. Накопление Хл вклетках мутантов и дикого типа(CC124) при переносе темновыхкультур на светуровня темновых культур дикого типа.Это означало, что продукт гена LTS3регулирует работу МХ в темноте.Штамм,условияростаГенотипТаблица 4.

Активность ферментов биосинтеза хлорофиллаCC124 (свет)CC124 (темн.)Lts3 (свет)Lts3 (темн.)wtwtlts3lts3Активность ферментов:Mg-хелатазаMg-ПП-метилтрансфераза АЛК9(nМоль/10 кл/час) (%)(%)(% )(kat/g)3,23 ± 0,341003,5 ± 0,111001002,57 ± 0,18792,7 ± 0,0877602,46 ± 0,72763,2 ± 0,0691910,72 ± 0,1223,3 ± 0,0794719Для выяснения влияния мутаций в гене LTS3 на экспрессию генов, кодирующихферменты биосинтеза Хл, изучали их транскрипцию (рис. 12). В отличие отдикого типа, в темновых культурах мутанта Lts3 не детектируютсятранскрипты генов МХ и GSA, а у мутанта yellow их уровень снижен.

Переносна свет клеток дикого типа ведет к активации этих генов через 1,5-2 ч, достигаяза четыре часа максимума. Для мутантов по гену LTS3 характерна задержкаактивации транскрипциисветом.Вкультурахсветовыхуровеньэкспрессииизучаемыхгенов у мутанта сходен стаковым у дикого типа, ипревышает его у генов:GTR, CHLH и CHLD.Рис.

12. Транскрипция генов C. reinhardtii,кодирующих ферменты синтеза АЛК (GTR, GSA,ALAD) и субъединицы магний-хелатазы (CHLH,CHLD и CHLI) у мутантов по темновому синтезу Хл.Аликвоты (10 µg) тотальных РНК из штамма дикоготипа СС124 и мутантов: Lts3 и Y-7 использованы дляНозерн-блот гибридизации с фрагментами кДНК геновинтереса.

Культуры выращивали в темноте (ПТ), насвету (ПС) и в условиях темнота – свет. Контроль пробы к гену Rbcs2 рибулозобифосфаткарбоксилазыСинтез субъединиц МХ:CHLH и CHLI у дикоготипаиотражаетмутантаLts3характернакопления мРНК генов,ихкодирующих(рис.13), свидетельствуя, чтоих экспрессия регулируется на транскрипционном уровне, и продукт гена LTS3необходим для транскрипции генов, кодирующих белки МХ, в темноте.

Такимобразом, мутации в гене LTS3 подавляют темновую транскрипцию генов,кодирующих МХ и фермента GSA из АЛК-синтезирующего комплекса.Рисунок 13. Иммуноблотинг белковCHLH и CHLI магний-хелатазы С.reinhardtii. Клетки штамма СС124 дикоготипа и мутанта Lts3 выращены в темноте(ПТ), при освещении темновых культур ина свету (ПС). Контроль – СRP - пробы кбелку plRpLl рибосом хлоропластов20Поиск гена LTS3 в геноме C. reinhardtii вели методами позиционногоклонирования и геномной комплементации, оптимальными для идентификациикартированных генов (рис.

14) с неизвестными функциями. Метод состоит втрансформации мутантных культур фрагментами геномной ДНК дикого типа всоставе библиотеки BAC-клонов [Rymarquis, 2005]. Результаты локализациигена LTS3 позволили из BAC-библиотеки C. reinhardtii выбрать 25 клонов,перекрывающих суммарно по геномной ДНК областьего вероятнойлокализации (~15сМ). Зеленые в темноте устойчивые к хлорамфениколутрансформанты появлялись только в случаях использования двух BAC-клонов:PTQ9626 и PTQ4402. Их ДНК компенсировали эффект мутантных аллелей генаLTS3 и содержали перекрывающиеся последовательности, свидетельствуя, чтообщий для них обоих участок размером 11,9 тпн, несет аллель дикого типа генаLTS3.

При сопоставлении последовательностей геномной ДНК, мРНК и ESTклонов в составе этого фрагмента обнаружили три ОРС. Повторнаятрансформация ДНК этих клонов, обработанных специфичными для каждойОРС рестриктазами, позволила найти искомый ген (рис. 15). Ген LTS3 (971 пн)содержит два экзона (58 пн и 257 пн) и интрон (156 пн). Его транскрипт (815пн) включает короткий (33 пн) 5’UTR, длинный (467 пн) 3’UTR, и ОРС (315пн), кодирующую белок из 104 аминокислотных остатков. В составе белкаРисунок 14. Генетическое и молекулярное картирование гена LTS3 в группесцепления I и в геноме C. reinhardtii.

Расстояния на генетической карте указаны всантиморганах, положение маркеров на хромосоме I - порядковым номеромнуклеотидов. Область перекрывания ДНК использованных BAC-клонов: 1853 3704 тпн. Положение аллелей дикого типа генов LTS3 и аc115 дано курсивом21LTS3обнаружен ДНК-связывающий цинк-пальцевый домен, типичный дляфакторовтранскрипциисемействаGATA(ФТ)(ZnF_GATA)растительного типа. Секвенированиепоказало, что результатом мутацийРисунок 15.

Структура гена LTS3brc-1 и lts3 в гене LTS3 стало отсутствие ZnF_GATA-структур у виртуальныхмутантных белков, что, по-видимому, привело к их дисфункции. Экспрессиюгена LTS3 изучали методом ОТ-ПЦР (рис. 16) и показали, что в норме (у дикоготипа - wt), она негативно регулируется светом, и позитивно – ацетатом. Впромоторных областях генов, кодирующих МХ и АЛК-комплекс, былиобнаружены цис-элементы GATA, узнаваемые ДНК-связывающими доменамиZnF_GATA (от одного – у ALAD и CHL1, до пяти – у GSA) иG-боксы(CACGTG), существенные для световой регуляции транскрипции (у генов GSA,CHLH и CHLD).

По-видимому, фактор LTS3 активирует транскрипцию геновМХ: CHLH, CHLD, CHLI и гена GSA, кодирующего фермент АЛКсинтезирующего комплекса в темноте, и необходим для их световой индукции.Поиск белков, гомологичных LTS3 (программа BLAST), в базах данных nr (Allnon-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF) показал,что его ортологи встречаются только у эукариот. Их гомология основана насходстве ДНК-связывающих GATA-доменов и позволяет отнести белок LTS3Рисунок 16. Транскрипция гена LTS3.

Уровень транскриптов гена LTS3определяли в клетках штамма дикого типа (wt), и мутантов, выращенных в темноте(Т), на свету (С) и после двух часов освещения (2ч) темновых культур. Контроль –экспрессия гена TUB2. Тотальную РНК обрабатывали ДНК-зой и проводилиобратную транскрипцию РНК-зависимой ДНК полимеразой M-MLV с праймерамиoligo-dT. Полученные кДНК (500 нг) служили матрицами для ПЦР-амплификациитранскриптов гена LTS3 с ген-специфичными праймерами. Ампликоны (10 мкл)визуализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозном геле в буфере TBЕ.Штаммы Brc-8 и Т8-3 описаны ниже (в разделе 3.4)22к семейству ZnF_GATA ФТ. Продукт гена LTS3 хламидомонады – первый,обнаруженный у водорослей ФТ, активирующий экспрессию генов магнийхелатазы в темноте.

Сам факт его существования свидетельствует, чтотемновой биосинтез Хл может обеспечиваться регуляторными элементами,действующими на уровне транскрипции. Таким образом, регуляторный генLTS3 у C. reinhardtii кодирует ФТ семейства ZnF_GATA, который активируеттранскрипцию генов ферментов ранних этапов биосинтеза Хл - магнийхелатазы и АЛК-синтезирующего комплекса в гетеротрофных условиях.3.4. Супрессия мутаций в гене LTS3 C. reinhardtii. Анализ супрессии мутантныхпризнаков – продуктивный подход к поиску альтернативных путей биосинтезапигментов. Предметом исследований механизмов регуляции синтеза Хл у C.reinhardtii стали ревертанты, полученные от пигментных мутантов по генуLTS3, кодирующему фактор транскрипционной регуляции генов ферментовсинтеза Хл: МХ и АЛК-комплекса.

Значительный интерес представлял поискдругихкомпонентовобеспечивающихрегуляторнойтемновоймашиныбиосинтезХлклеткивC.условияхreinhardii,отсутствияфункционального белка LTS3. Для их обнаружения, из клеточной культурымутанта Brc-1 по гену LTS3, был отобран зеленый в темноте спонтанныйревертант Brc-8. Сходный уровень содержания Хл в его темновых и световыхкультурах (табл. 6), свидетельствовал о восстановлении темнового синтеза Хл.Гибридологический анализ позволил ответить на вопрос, наследуется лиспособность штамма Brc-8 зеленеть в темноте. Тетрадный анализ показал, чтопризнак наследуется, и реверсия произошла в результате единичной ядерноймутации sup-3 в гене SUP-3, который сцеплен с геном LTS3 C. reinhardtii.Эффект мутации не аллелоспецифичен, – она супрессирует обе мутантныеаллели гена LTS3.

Мутация sup-3 рецессивна – диплоиды, гетерозиготные поsup-3 на фоне гомозиготы: brc-1/brc-1, формировали оранжевые в темнотеколонии.Наличиемежгеннойсупрессиииотсутствиееѐаллельнойспецифичности свидетельствовало о включении альтернативного механизма23Таблица 6. Содержание пигментов в клетках мутантов по гену LTS3ШтаммУсловияГенотипПигменты (nMol/109клеток)©ППMgПППдХлCC124темнотаwt0,30,200,82480CC124светwt0,190,20н3280Brc-1темнотаbrc-112,300,543,412,9Brc-1светbrc-10,370,67н2420Brc-8светbrc-1,arg7,sup-30,2н2510Brc-8темнотаbrc-1,arg7,sup-3нн14,52320*T-8-3темнотаbr-1,arg7,sup-3,sup-I7,50,353,59,3© - Метод спектрофлуориметрии; даны средние значения величин, полученных в 3-6повторностях. Ошибки не превышают 5%.

Характеристики

Список файлов диссертации

Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii
Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6390
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее