Автореферат (1144822), страница 5
Текст из файла (страница 5)
* - штамм будет описан ниже.регуляции. По-видимому, фактор SUP-3 в норме репрессирует темновойбиосинтеза Хл, а мутация sup-3 блокирует эту функцию. Учитывая свойствапродукта гена LTS3 активировать в темноте транскрипцию генов МХ,предположили, что в случае его дисфункции в клетках водоросли включаетсяальтернативный путь темновой активации экспрессии этих генов (W2), в норме,находящийся под негативным контролем белка SUP-3. Восстановлениеспособности синтезировать Хл у ревертанта Brc-8 связано с усилениемактивности МХ в темноте (рис. 17).
Она в 7 раз превышала активность этогофермента в темновых культурах исходного мутанта Brc-1 и снижалась на свету,означая, что путь W2 негативно регулируется светом. SUP-3 – сильныйрепрессор, – мутация в гене SUP3велакдвукратномуповышению активности МХ втемноте даже по сравнению сдиким типом. Ген SUP-I. Дляобнаружениядополнительныхфакторов активации синтеза Хл втемноте,Рис. 17.
Активность магний-хелатазы (МХ)наосновезеленогоревертанта Brc-8 был получен24мутант Т8-3 (рис. 18), у которого инсерция sup-Iпривела к возврату фенотипа исходного оранжевоговтемнотештаммаBrc-1.Пигментныйсоставтемновых культур мутантов Т8-3 и Brc-1 одинаков –они накапливают ПП и небольшое количество егомагниевых производных (табл. 6, см. выше), однакотрансформант утратил способность расти и зеленетьРисунок 18.
Получениештамма Т8-3на свету. Методами тетрадного и семейного анализов потомства скрещиванийштамма Т8-3 с мутантами по гену LTS3 и штаммами дикого типа былоустановлено, что инсерция наследуется по моногенной схеме, и мутацииоранжевости не рекомбинируют и не комплементируют. Генетический анализ иизучение пигментного состава клеток Т8-3 позволили определить его генотип:brc-1,sup-3,sup-I, подтвердив, что оранжевая в темноте окраска клеток T-8-3обусловлена мутацией brc-1 в гене LTS3. Высокий уровень активность МХ,выявленный у трансформанта (рис. 17), сопоставимый с таковым у ревертантаBrc-8, указал, что эффект мутации sup-3 сохранен в его клетках, но инсерция(sup-I) блокировала способность к зеленению.
На фоне гомозиготы помутациям в гене LTS3 проявление аллели sup-I, – потеря способности кзеленению, носит доминантный характер, – признак сохранялся у гетерозиготsup-I/+.Приэтом,дигетерозиготыфотоавтотрофно. Эффектlts3/+,sup-I/+инсерционноймутации(порастутнасветудоминантному/рецессивному типу) зависит от отсутствия / наличия в клетке продукта генаLTS3, означая, что, гены LTS3 и SUP-I взаимодействуют, и продуктделетированного гена, названного намиSUP-I, активен при наличиинормального белка LTS3. Для идентификациигенометрансформантаТ8-3,фланкирующиегена SUP-I C.
reinhardtii винсерциюнуклеотидныепоследовательности искали методом «Ligation-mediated suppression-PCR».Инсерция оказалась встроенной в хромосому 13 в положении 1194741 пн. ВБазе данных геномного проекта была найдена мРНК (au5.g4469_t1), которая25принадлежит гену SUP-I, локализованному на хромосоме 13 (в положении:1193966-1195740). Его структура (рис. 19) была воссоздана путем сравнениянуклеотидных последовательностей геномной ДНК и транскрипта этого гена.Ген SUP-I включает 2 интрона, первый из которых расположен в 5’некодирующей области. Транскрипт размером 933 пар оснований кодируетбелок (виртуальный) из 108 аминокислотных остатков массой 11,5 kDа.Область (–800 – +1) этого гена содержит несколько элементов GATA –мишенейтранскрипционнойхлоропластныхирегуляциимитохондриальныхФТ.ZnF_GATAтранзитныхОтсутствиепоследовательностей(программы: ChloroP и mitoprot) и наличие сайта фосфорилированияпротеинкиназой С (PKC) свидетельствуют, что, белок SUP-I функционирует вядре и задействован в сигнальной трансдукции.
Оценка его влияния наэкспрессию гена LTS3 (рис. 16, с.22) показала, что выключение гена SUP-I утрансформанта Т8-3 резко снижает уровень LTS3-транскриптов. По-видимому,белок SUP-I участвует в активации транскрипции гена LTS3 в темноте, и обабелка LTS3 и SUP-Iвходятвсоставрегуляторной системы,контролирующейработу МХ. Белок SUPРисунок 19. Структура гена SUP-I C.
reinhardtii (а) иаминокислотная последовательность белка SUP-1 (б).Стрелка - место инсерции в геноме штамма T8-3.Прямоугольники - экзоны, линии - интроны. Цифрыуказываютразмеры экзонов (вверху) и интронов(снизу). Рамкой обведен сайт фосфорилирования РКС3, в норме подавляетинойпутьактивации(W2)МХухламидомонады.3.5. Изучение генетической регуляции биосинтеза Хл на модели мутантов C.reinhardtii по гену CHL H. Протопорфирин IX (ПП) - самый фототоксичный изокрашенных предшественников Хл. Будучи в свободном состоянии, на свету онгенерирует активные формы кислорода, разрушающие липиды клеточныхмембран [Красновский, 2001]. Механизмы, препятствующие накоплению ПП,26изучали на модели накапливающих ПП мутантов C.
reinhardtii по гену CHLH. Врезультате УФ-мутагенеза и последующего многоступенчатого отбора темноокрашенных коричневых клонов, были полученыштаммы (рис. 20, табл. 7.1), накапливающие болеечем в 20 раз больше ПП, чем одиночный мутантгенотипаchl1.Генетическуюприродутакогофенотипа у наиболее продуктивного по ПП штаммаРисунок 20. Мутанты,накапливающие ППH-19-25(mt-) выясняли методом гибридологического анализа.
В потомствескрещивания его на штамм дикого типа (С1525) только 2 из 42 полных тетрадсодержали коричневые (кор) клоны (табл. 7.2). В большинстве тетраднаблюдалинормальное(ор):2зеленым(зел).расщеплениеНапротив,впомутацииреципрокномchl1:2оранжевыхскрещивании(С1712)коричневые колонии появлялись в составе 96% тетрад. Однородительская (отmt+) передача признака означала хлоропластную природу изучаемой мутации,названной mod-u-25. Метаболическая регуляция биосинтеза Хл у высшихрастений и зеленых водорослей осуществляется гемом и Пд путем обратногоингибирования синтеза АЛК [Tanaka, 2007].
В клетках мутантов по гену CHLH,не содержащих Пд, мутация mod–u-25 не влияет на синтез гема. Еѐ эффектТаблица 7.1. Содержание хлорофилла и его предшественниковГенотипФенотипНакопление ХЛ* и его предшественников:окраска колонийАЛК1ППХлорофилл79(nM/10 кл)(μM/10 кл)(μM/109кл)wt (свет)зеленая3,01±0,041н.о.4,12±0,046wtзеленая.2,14±0,041н. о.3,46±0,002chl1оранжевая2,58±0,0540,182±0,00370,0012chl1,mod-u-25коричневая5,33±0,0584,593±0,03210,007chl1,mod-u-25коричневая5,18±0,0124,314±0,00420,005mod-u-25зеленая3,10±0,035н.о.3,516±0,008lts3оранжевая1,70±0.0140,049±0,0020,015lts3,mod-u-25коричневая3,36±0.0271,337±0,0160,0171- относительная АЛК-синтетазная активность определяется количеством АЛК,которое клетки накапливают при обработке сублетальными дозами (4mМ)левулиновой кислоты (ЛК); 2- штамм H-19-25.
Обозначения: н.о. – не обнаружено.27Таблица 7.2. Тетрадный анализ потомства зигот скрещиваний коричневыхмутантов C. reinhardtii на штаммы дикого типаНомерскрещивания15251712Генотипы родителейmt(+)mt(-)wtchl1,mod-u-25Число тетрад с расщеплением:Передача2зел 2зел:2 4зел 2зел : 1ор ∑ признакаот mt(+): 2оркор*: 1кор.302100424,75%120402596%chl1,mod-u-25wt* Тетрады из 4-х зеленых колоний оказались митотическим потомством вегетативныхдиплоидов - cредний объем их клеток (около 208 мкм) и единообразие по типу спаривания все mt(-) соответствовали критериям диплоидности клеток С.
reinhardtii [Harris, 1989]состоит в усилении активности АЛК-синтезирующего комплекса (табл.7.1), ˗ укоричневых штаммов с высоким содержанием ПП она увеличена вдвое посравнению с одиночными мутантами генотипа: chl1, lts3 и штаммом дикоготипа. Повышенная активность комплекса АЛК-ферментов у штамма Н-19-25детектировали по устойчивости к левулиновой кислоте (ЛК) – конкурентномуингибитору синтеза АЛК, в концентрации 10 mM, губительной для клетокдикого типа и одиночных мутантов по генам CHLH и LTS3. Признакустойчивости к ЛК также наследуется как хлоропластный детерминант – отродителя mt(+). Таким образом, mod-u-25 – мутация хлоропластного гена,которая приводит к усилению синтеза АЛК и может быть тестирована поустойчивостиклетокк10mMЛК.Причиной сверхпродукции АЛК и ПП втемновых культурах двойных мутантовгенотипа ch1l,mod-u-25 (рис. 21), сталоусиление в темноте транскрипции генов,кодирующих ферменты их синтеза: GTR(глутамил-тРНКсубъединицыредуктазы), CHLH (HМХ)ибелкаCABIIсветособирающего комплекса фотосистемы2.
Уровень транскриптов этих генов уРис. 21. Экспрессия генов CHLHи GTR C. reinhardtii в клеткахдикого типа (wt) и двойногомутанта генотипа: chl1,mod-u-25.Нозерн-блот гибридизация с генспецифичными пробами. CBLP –контроль. Т – темнота28двойного мутанта (chl1,mod-u-25) в отличие от wt, не репрессирован в темноте,что характерно для мутантов по ретроградному контролю – передаче сигналовиз хлоропласта в ядро.ЗАКЛЮЧЕНИЕМолекулярно-генетические механизмы контроля ранних этапов цепибиосинтеза Хл – от ПП до Пд у одноклеточной зеленой водоросли C. reinhardtiiизучали методами генетики, молекулярной биологии и биохимии на моделибесхлорофилльных мутантов с нарушенной конверсией ПП и их ревертантов.Причиной мутантного фенотипа (клетки накапливали ПП и формировалиоранжевые колонии в гетеротрофных условиях) стало подавление активностифермента МХ, встраивающего магний в молекулы ПП в цепи биосинтеза Хл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
