Автореферат (1144822), страница 2
Текст из файла (страница 2)
reinhardtii.Научная новизна работы. В работе получены фундаментальные знания огенетических механизмах регуляции темновых процессов биосинтеза Хл узеленой водоросли C. reinhardtii. Исследованы ядерные гены CHLH и LTS3 C.reinhardtii, мутации в которых нарушают биосинтез Хл и ведут к накоплениюклетками водоросли его интермедиата – ПП.
Установлено, что продукты этихгенов необходимы для функционирования фермента магний-хелатазы (МХ),конвертирующего ПП в Mg-ПП. Мутации в гене CHLH останавливают синтезХл в условиях роста в темноте и на свету. У мутантов по гену LTS3 блокировантолько темновой синтез Хл, но сохраняется способность зеленеть на свету.Впервые у зеленых водорослей осуществлено клонирование гена CHLH С.reinhardtii, кодирующего H-субъединицу МХ.
Исследованы его структура ифункции. Обнаружен новый регуляторный ген LTS3 C. reinhardtii, кодирующийфактор активации транскрипции генов МХ в темноте. Установлено, чтокодируемый им белок – первый, описанный у водорослей фактор транскрипциисемействаGATA,регулирующийэкспрессиюгеновбиосинтезаХл.Идентифицировано два новых ядерных гена C. reinhardtii: SUP-3 и SUP-I. ГенSUP-3 кодирует фактор негативной регуляции активности МХ, а продукт генаSUP-I активирует транскрипцию гена LTS3 и необходим для процессазеленения–индуцированногосветомсинтезаХл.Выявленновыйхлоропластный ген хламидомонады Mod-u-25, продукт которого регулируетуровень содержания ПП в клетке.8Теоретическая и практическая значимость. В работе впервые установлено,что темновой биосинтез Хл у зеленой водоросли C.
reinhardtii регулируется науровне транскрипции – путем активации генов, кодирующих фермент МХ.Найдены ядерные гены LTS3 и SUP-I, кодирующие факторы транскрипционнойактивации МХ в темноте. Клонирован ген CHLH большой субъединицы МХ C.reinhardtii. Описан хлоропластный ген Mod-u-25. Он кодирует регуляторныйфактор, обеспечивающий низкий уровень содержания фотосенсибилизатора ППв клетке путем подавления активности ферментов синтеза АЛК.
Разработанэкспресс-метод оценки продуктивности по ПП штаммов C. reinhardtii. Наоснове мутантов по гену CHLH с нарушенной регуляцией получены штаммыпродуценты ПП, два из которых защищены авторскими свидетельствами (№1369275, и № 1759231) и могут быть использованы для микробиологическогосинтеза ПП - фотосенсибилизатора, необходимого для фотодинамическойтерапии рака и при создании альтернативных источников энергии.Положения, выносимые на защиту:− Помимо темновой Пд-оксидоредуктазы, у зеленой водоросли C.reinhardtii биосинтез Хл в темноте обеспечивает транскрипционная регуляциягенов МХ – фермента, конвертирующего ПП в Mg-ПП в цепи биосинтеза Хл.− Ген CHLH C. reinhardtii кодирует H-субъединицу МХ, а мутации в этомгене останавливают синтез Хл в условиях роста в темноте и на свету.− Ген LTS3 C.
reinhardtii кодирует фактор активации транскрипции геновМХ в темноте. Это первый, обнаруженный у водорослей фактор транскрипциисемейства GATA, регулирующий экспрессию генов биосинтеза Хл.− Ядерный ген SUP-3 C. reinhardtii кодирует фактор негативнойрегуляции активности МХ, а продукт гена SUP-I активирует транскрипциюгена LTS3 и необходим для процесса зеленения – индуцированного светомсинтеза Хл.– Продукт обнаруженного в работе хлоропластного гена Mod-u-259подавляет активность ферментов синтеза АЛК, препятствуя накоплениюфотосенсибилизатора ПП в клетке.Степень достоверности и апробация результатов. Данные диссертациипредставлены в более чем 50 публикациях, 20 из которых - в рецензируемыхжурналахиизданиях,рекомендованныхВАК,идвухавторскихсвидетельствах. Результаты работы были доложены на международных ироссийских конференциях: девяти конференциях по клеточной и молекулярнойбиологии хламидомонады (International Conference on the Cell and MolecularBiology of Сhlamydomonas) с 1994 по 2014 годы; на X и XV Конгрессах пофотосинтезу (International Congress on Photosynthesis, 1995, 2010); на III съездеEMBO (European Molecular Biology Organization, 2011); Международнойшколе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва,2006); V съезде ВОГиС (Москва,2009); на Пущинских чтениях по фотосинтезу(Пущино, 2009, 2012); Международной конференции “Роль организации иэкспрессии генетического материала в наследственной и ненаследственнойизменчивости”(Санкт-Петербург,2009);Vмеждународномконгрессе«БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития»(Москва, 2009).ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫДиссертация изложена на 337 страницах и состоит из следующихразделов: введение, обзор литературы (1), материалы и методы (2),экспериментальная часть (3), заключение, выводы и список цитируемойлитературы (390 наименований, из которых 50 – на русском языке).
Работасодержит 76 рисунков и 49 таблиц.Введение. Сформулирована фундаментальная научная проблема –выяснениемеханизмоврегуляциипроцессовбиосинтезаХлвфотосинтезирующей клетке. Определены предмет изучения, цели и задачиработы, сформулированы положения, выносимые на защиту.Раздел 1. Обзор литературы описывает современное состояние10генетическихисследованийметаболизмаХл.Онвключаетобщуюхарактеристику природных тетрапирролов (1.1), описание различных форм Хл(1.2), современное состояние генетических исследований биосинтеза Хл (1.3).Подробно рассмотрены темновой и светозависимый пути превращения Пд в Хдв биосинтезе Хл (1.4).
Представлены результаты исследований катаболизма Хлв растительной клетке (1.5), отражены эволюционные аспекты метаболизма Хл(1.6) и обсуждаются механизмы регуляции его биосинтеза (1.7).Раздел 2. Материалы и методы содержат описание штаммов C.reinhardtii, использованных в работе (2.1), условий их культивирования (2.2) иметодов тестирования мутаций (2.3-2.7). В работе применяли методы генетики,биохимии и молекулярной биологии. Наряду с классическими методикамигибридологического анализа (2.8), описаны биохимические и биофизическиеметоды изучения пигментного состава и активности ферментов биосинтеза Хлв клетках C.
reinhardtii (2.9-2.13). Классический генетический анализ(тетрадныйанализ,рекомбинационныйикомплементационныйтесты)позволил изучить наследование изучаемых генов и аллельность мутацийбесхлорофильности. Биохимическими и биофизическими методами былиопределены пигментный состав и активности ферментов биосинтеза Хл вклетках C. reinhardtii (мутантов, ревертантов, трансформантов). Клонированиегенов и анализ их экспрессии осуществляли методами молекулярной биологииC.reinhardtii (2.14-2.17): выделение и анализ ДНК, РНК и белков; гибридизация,ПЦР-амплификация и ОТ-ПЦР; генетическая трансформация. Описаны методыстатистической обработки данных (2.18) и методы биоинформатики (2.19).
Вработе использовали базы данных генетической информации и компьютерныепрограммы сравнительного анализа структуры и функций молекул ДНК, РНК ибелков доступные на сайтах: NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov); ExPASy(http://www.expasy.ch/tools);игеномногопроектаС.reinhardtii(http://www.genome.jgi-psf.org).Раздел 3. Экспериментальные исследования состоит из 5 подразделов.113.1.Генетико-биохимическиеисследованиямутантовC.reinhardtii,накапливающих протопорфирин. Изучали группу фенотипически-сходныххлорофильных оранжевых мутантов C. reinhardtii (ХОМ) из Петергофскойгенетической коллекции штаммов зеленых водорослей [Квитко и др., 1983]. Ихклетки не синтезируют Хл и в гетеротрофных условиях накапливают бурыйпигмент порфириновой природы, придающий колониям желто-оранжевуюокраску (рис.
3). Описаны эксперименты по первичной характеристикемутантов (3.1.1), их гибридологическому анализу (3.1.2) и изучению ихметодами биохимии (3.1.3). Спектральные характеристики нативных культурХОМ свидетельствовали о наличии в их клетках пигмента с максимумомпоглощения в области 540 нм, характерного для протопорфиринов –интермедиатов биосинтеза Хл. Мутанты разделились на две фенотипическиегруппы – светочувствительные и зеленеющие на свету.
ХОМ, вместе сполученными из США штаммами Brs-1 и Brc-1сходного фенотипа [Wang et al.,1974] были вовлечены в гибридологический анализ для выяснения характеранаследования и установления аллельности анализируемых мутаций. Оказалось,что все они рецессивны и принадлежат двум ядерным генам: CHL1 и LTS3,представленным рядом аллелей: chl1, brs-1, or3, or2/5, or5, lts7 и lts3-122, brc-1,or13, or69, соответственно. Это означало, что два ядерных гена CHL1 и LTS3C. reinhardtii контролируют ранние этапы биосинтеза Хл.Для картирования CHL1 и LTS3, мутантные по этим генам штаммыскрещивали с ауксотрофными и множественно-маркированными линиями.CHLH (CHl-1)LTS3Рисунок 3. Фенотип ХОМ по генам CHLH (CHL1) и LTS3, штаммов yellow (Y1) и дикого типа: СС124 и 137С(+), растущих в темноте и на свету12Тетрадный анализ их потомства (табл.
1) показал свободную рекомбинациюмутаций в этих генах с маркерами групп сцепления (ГЦ):VI, X и XI и слабоеТаблица 1.Тетрадный анализ потомства скрещиваний ХОММаркеры и их локализация:маркерГЦ*msr-1I /43/pf-14VI /12/act-2VI /44/nic-13X /3/pf-2XI /2/mtVI /24/LTS3P:N:T** P (P=N)29:7:30 0,017:8:17 0,993:5:12 0,957:7:18 0,9918:17:47 0,99CHL1P:N:T** P (P=N)5:11:27 0,953:2:9 0,9525:12:43 0,057:9:9 0,9518:18:35 0,99****ГЦ – группа сцепления /в скобках даны расстояния (сМ) маркера от центромеры/;** – дитипы: родительские (Р), неродительские (N) и тетратипы (Т);*** – нерегулярное расщепление.сцепление гена LTS3 (33 сМ) с маркером ГЦ I, – соотношения Р:N достоверноне отличались от 1:1 во всех вариантах, кроме пары: lts3 - msr-1 (P0,001).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
