Диссертация (1144259), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Мембранные белки могутбыть экстрагированы из липидных мембран детергентами. Детергенты – этонебольшие амфипатические молекулы, состоящие из полярной и неполярнойчастей. Солюбилизированные мембранные белки приобретают способностьрастворяться в воде, где они находятся в виде комплексов (мицелл) с детергентом.Нередко, экстракция в присутствии детергентов приводит к потере нативнойструктурыилиферментативнойактивности.Наиболееэффективнымсфункциональной точки зрения, но в то же время трудоемким, является методреконструкции (инкрустация) интегральных мембранных белков в искусственныелипидные бислои.
Это позволяет изучать белковые молекулы в максимальноблизком к нативному состоянии. При этом, как правило, требуется решитьследующие задачи: подобрать экспрессионную систему и экспрессироватьправильно свернутый белок интереса; оптимизировать условия выделения иочистки рекомбинантного белка из мембран; и, что немаловажно, подобратьусловия для обратной реконструкции белка в искусственные липидные бислои.Несмотря на значительный прогресс последних десятилетий в области изучениямембранных белков в липидном окружении, лишь несколько десятков из нихбыли функционально реконструированы в модельные липидные бислои . Однако,только подобный подход позволяет в полной мере изучить белок-липидныевзаимодействия интересующего белка, поскольку позволяет контролироватьтакие переменные, как концентрация белка в модельной мембране, липидныйсостав и фазовые свойства последней.1.3.4.1 Липидный состав биологических мембранКак было сказано в предыдущей главе, одним из наиболее интересных иактуальныхнаправленийбиофизикимембранныхбелковявляетсяихреконструкция в искусственные липидные бислои.
Долгое время биологическиемембраны воспринимались как пассивные «растворители» и структурные каркасыдля функционирования белков, а не как активные участники биологических- 35 -процессов. Однако, в настоящее время очевидно, что белки и липиды биомембранфункционируют кооперативно во многих биологически важных процессах, такихкак везикулярный транспорт, проведение сигнала, слияние и отпочковываниевезикул, сортировка белков. При этом, липидный состав мембран оказываетвлияние как на локализацию, так и функцию многих белковых молекул, а белки, всвою очередь, нередко выступают в роли модуляторов липидного бислоя.
Крометого, существует транс-бислойная (между внешним и внутренним монослоямимембраны) и латеральная (в пределах одного монослоя) ассиметрия составабиомембран.Исследования показали, что липидный состав неодинаков в различныхклеточных компартментах и строго регулируется на клеточном уровне [164].Основными классами липидов, составляющими биологические мембраны,являются следующие: фосфолипиды (глицерофосфолипиды и сфинголипиды),стероиды (холестерин у животных), гликолипиды (например, ганглиозиды) (рис.4).
Основным структурным компонентом биологических мембран являютсяглицерофосфолипиды: фосфатидилхолины (ФХ), фосфатидилэтаноламины (ФЭ),фосфатидилсерины (ФС), фосфатидилинозитолы (ФИ), фосфатидная кислоты(ФК) (рис. 4). ФХ являются одними из самых распространенных компонентовклеточных мембран, и, в целом, составляют более 50% всех фосфолипидов. ФИпредставлены в небольшом количестве, но играют важную роль в проведениисигнальных каскадов.
Большинство ФХ содержат одну ненасыщенную ацильнуюцепь и бислои, построенные из чистых ФХ, обычно текучи.Сфинголипиды представляют другой подтип фосфолипидов. Этот класспостроен на основе спирта сфингозина и остатка жирной кислоты. Наиболееширокораспространеннымпредставителемсфинголипидов(особенно,вмиелиновых мембранах) являются сфингомиелины (СМ), которые имеютзаряженную полярную группу фосфохолина или фосфоэтаноламина. Жирныекислоты, образующие сфинголипиды, являются насыщенными и образуют болееплотно упакованные липидные бислои. Стеролы (холестерин у животных)являютсяещеоднимважнымкомпонентомбиологическихмембран.- 36 -Взаимодействие холестерина с мембранными липидами изменяет физикохимические свойства липидного бислоя, такие как текучесть и температурафазового перехода гель-жидкость.
Кроме того, наличие холестерина необходимодля возникновения латеральной ассиметрии в биологических мембранах.Рис. 4 Основные липиды биологических мембран: глицерофосфолипиды(фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины, фосфатидилинозитолы),сфинголипиды (сфингомиелины), стеролы (холестерол), гликолипиды (ганглиозиды)1.3.4.2 Латеральная ассиметрия, фазовый состав клеточных мембран ирафтовые микродоменыЛатеральная асимметрия в биологических мембранах проявляется всосуществовании различных липидных микродоменов в пределах одноголипидного бислоя. Микродомены характеризуются определенным липиднымсоставом, белковыми компонентами, степенью упорядоченности, и отличными отостальной части мембраны физико-химическими параметрами, в частности,такими, как толщина бислоя, текучесть.
Одним из типов липидных микродоменов- 37 -являются липидные рафты (rafts) или плотики, которые обогащены холестериноми насыщенными липидами (как правило, сфингомиелинами) [164]. Липидныерафтовые домены (размером в несколько микрометров) наблюдаются in vitro вискусственных липидных смесях и везикулах, полученых из плазматическихмембран клеток [165-170]. Рафты могут быть биохимически выделены в видемембран, устойчивых к экстракции мягкими неионными детергентами, такимикак Triton X-100, Triton X-114, Brij98 [171, 172]. Кроме того, спустя много летисследований, существование липидных микродоменов нанометрового масштабабылопоказаноспомощьюмикроскопиивысокогоразрешения[173].Сформулированная в конце XX века гипотеза о существовании липидных рафтов,таким образом, в настоящее время претерпела ряд уточнений: в настоящее времясчитается, что липидные рафты представляют собой небольшие (5-100 нм)высокодинамичные липидные платформы, отличающиеся по своему липидному ибелковому составу от остальной части мембраны и принимающие участие впроведении сигнала, сортировке белков, везикулярном транспорте и ряде другихбиологически важных процессов.
Таким образом с функциональной точки зрения,липидные микродомены являются платформами, пространственно-разобщаялипидные и белковые молекулы, которые, в отсутствие микродоменов, были быравномерно распределены в бислое.Фазовое разделение в биологических мембранах связано со структурнымиособенностями липидных молекул. Липид-липидные взаимодействия определяютфазовое поведение в бислоях, что означает, что гетерогенные смеси могут вотсуствие дополнительных белковых факторов спонтанно разделяться наразличные липидные фазы. Как было указано ранее, сфингомиелины содержат всвоей структуре длинные насыщенные жирные кислоты, и бислои, построенныеиз СМ, имеют кристаллоподобную упаковку (фаза So, solid-ordered) ихарактеризуются высокой степенью упорядоченности и низким коэффициентомлатеральной диффузии составляющих их липидных молекул.
Напротив, ФЛ,содержащие в своем составе остатки ненасыщенных жирных кислот, образуютжидкуюлипидную(разупорядоченную)фазуLd(liquid-disordered),- 38 -характеризующуюсянизкойстепеньюупорядоченностиивысокимкоэффициентом латеральной диффузии. Холестерин сам по себе не образуетлипидные бислои, но, являясь структурным компонентом мембран, способенвместе с насыщенными липидами образовывать жидкую упорядоченнуюлипидную фазу Lo (liquid-ordered). В отличие от So фазы, которая обнаруживаетсяпри температурах ниже температуры плавления липидов (как правило, внефизиологического диапазона температур), Ld и Lo фазы способны сосуществовать при физиологических условиях (рис.
5).Рис. 5. Пример фазовой диаграммы тройной липидной смеси ДОФХ:ДПФХ:холестерол.Область, обозначенная белым цветом – Ld (жидкая разупорядоченная) фаза, светло-серым –область сосуществования Ld и Lo (жидкой упорядоченной) фаз, темно-серым – областьсосуществования Ld и So (твердой упорядоченной фаз) (адаптировано из [174]). Вкладка:примеры фазового разделения Lo-Ld в «гигантских» одномембранных липосомах (иллюстрацииавтора).1.3.4.3 Рафты в эндоплазматическом ретикулумеКак было указано ранее, рецептор сигма-1 является резидентным белкомэндоплазматического ретикулума. Липидный состав мембран ЭР значительноотличается от ПМ, в частности в мембранах ЭР относительно небольшоеколичество холестерина и сфингомиелинов [164]. Эти структурные особенностибиомембран ЭР долгое время препятствовали распространению рафтовойгипотезы за пределы плазматической мембраны клетки.
Однако, к настоящему- 39 -времени было показано, что определенные суб-компартменты ЭР и аппаратаГольджи характеризуются особым липидным составом [175-179]. В частности,холестерином и церамидами богаты контактные области ЭР, в том числемембраны ЭР, ассоциированные с митохондриями (МАМ) [177-180]. Данныеобласти, прилежащие к митохондриям, функционируют как платформы дляправильной коммуникации между двумя органеллами. Изветсно, что нарушения втакойкоммуникацияиразобщениеЭР-митохондриальныйконтактовнаблюдается при различных заболевания и в условиях стресса ЭР [181-183].1.3.5 «Гигантские» одномембранные липосомы как биофизическая модельклеточных мембранБольшое количество классических биофизических работ посвященоизучениюивизуализациифазовыхпереходовLd-Loв«гигантских»одномембранных липосомах (ГОЛ, giant unilamellar vesciles, GUV) [165-170]. ГОЛимеют размер d>10 мкм, что позволяет непосредственно визуализировать их спомощью конфокальной микроскопии.
Именно с помощью данного методавпервые было показано спонтанное макроскопическое разделение липидныхсмесей на со-существующие рафтовые и нерафтовые фазы in vitro. Липосомы,полученныеизискусственныхилиприродныхлипидов,могутбытьвизуализированы с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопапутем введения флуоресцентно-меченых липидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
