Диссертация (1144259), страница 9

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

Через 3-5 дней (оптимальное время наработки вируса определяли попроцентному соотношению клеток в культуре при окраске трипановым синим,которое должно было составлять 30-50%) культуральную среду собирали ифильтровали (вирус второго пассажа P2). Вирус высокого титра (P3) получализаражением 50 мл культуры вирусом P2 в разведении 1:500 и последующимкультивированием клеток в течении 3-5 дней. Вирус высокого титра P3фильтровали и аликвотировали, замораживали и хранили при -80 °С. Экспрессиюбелка 6-His-S1R осуществляли заражением культуры клеток Sf9 вирусом P3 вразведении1:1000втечение72часов.центрифугированием и хранили при -80 °С.Клеточныйосадоксобирали- 46 -Выделение и очистка рекомбинантного рецептора сигма-1. Клеточныйосадок (полученный после осаждения центрифугированием 1 л суспензионнойкультуры) ресуспендировали в 50 мл гипотонического буфера для лизиса (20 мМHEPES pH=8,0, 1 мМ PMSF, 1x Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail) илизировали с помощью обработки ультразвуком в течение 5 циклов по однойминуте каждый, амплитуда 50%, в пульсовом режиме 1 с: 1 с (Branson Sonifier450, США).

Неразрушенные клетки и обломки осаждали центрифугированиемпри 6000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали, после чегоклеточные мембраны осаждали центрифугированием при 100000 g в течение1 часа (роток Ti45, Beckman-Coulter). Клеточные мембраны ресуспендировали в10 мл буфера для экстракции (20 мМ HEPES pH=8,0, 200 мМ NaCl, 10% глицерол)и экстрагировали детергентом LDAO (лаурилдиметиламиноксид, Anatrace, США).Буфер для экстракции также содержал 0,1% холестерил гемисукцината (Anatrace,США). Экстракцию проводили в течение ночи при 4 °С, после чегонерастворимую фракцию осаждали центрифугированием 100000 g в течениеодногочаса.Надосадочнуюфракциюуравновешенной никель-агарозной смолойсмешивалиспредварительноNi-NTA (Qiagen Германия) иинкубировали в течение одного часа при 4 °С и перемешивании.

После этогосмолу промывали 10-кратным объемом буфера для промывки (20 мМ HEPESpH=8,0, 200 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,1% LDAO, 0,01% холестерин, 0,05%фосфолипиды куриного яйца) и 10-кратным объемом буфера для промывки 2,содержащим30 мМимидазол.Элюциюбелковосуществлялибуфером,содержащим 150 мМ имидазол.Фракции, содержащие рецептор сигма-1, собирали и наносили наанионообменную колонку monoQ 5/50 (Akta, Швеция) в буфере А (20 мМ MOPSpH=7,5, 0,1% LDAO 0,01% холестерин, 0,05% фосфолипиды куриного яйца) иэлюировали линейным градиентом NaCl (буфер Б: 20 мМ MOPS pH=7,5, 1 МNaCl, 0.1% LDAO, 0,01% холестерин, 0,05% фосфолипиды куриного яйца).Фракции,содержащиерецепторсигма-1собирали ииспользовалидляковалентного мечения с помощью флуорофора NHS-Alexa Fluor 555 (N-- 47 -гидроксисукцинимид-Alexa555, Molecular Probes, США).

Для этого pH белковогораствора подводили до pH=8,0 и ковалентно сшивали с флуорофором (4 мМ NHSAlexa555 в ДМСО, 3-х кратный молярный избыток по отношению к белку) втечение одного часа при комнатной температуре. Флуоресцентно-меченый белокотделяли от красителя с помощью гель-фильтрации на хроматографическойколонке Superdex 200 10/300 (GE Healthcare, США) в буфере для гель-фильтрации(20 мМ HEPES pH=8,0, 200 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,1% LDAO, 0,01%холестерол, 0,05% фосфолипиды куриного яйца), фракции олигомерногорецептора собирали и концентрировали с помощью фильтров Amicon 50 kDa(EMD Millipore, Германия) до конечной концентрации 1 мг/мл. Измерениеконцентрации выделенного белка осуществляли колориметрически по методу сбицинхониновой кислотой BCA protein assay kit (Pierce, США).

Чистотувыделения белкового препарата анализировали путем электрофореза в ПААГ гелес последующей окраской коллоидным красителем Кумасси R-250 (EZ Blue,Sigma-Aldrich, США) и Вестерн-блот анализом с окраской специфичнымимоноклональными антителами против рецептора сигма-1 (B-5, Santa Cruz, США).2.2.3 Разделение белков в ПААГ и иммуноблоттинг (вестерн-блот анализ)Для анализа белков использовался электрофорез в полиакриламидном геле вденатурирующих условиях по системе Лэммли (4% концентрирующий, 8-12%разделяющий гели, в зависимости от спектра масс анализируемых белков). Длявизуализации белков после разделения использовался коллоидный красительКумасси R-250 (EZ Blue, Sigma-Aldrich, США).Для Вестерн-блот анализа белки переносились на нитроцеллюлозныемембраны (BioRad, США) с помощью аппарата для полусухого переноса TransBlot SD Semi-Dry Transfer Cell (BioRad, США) в стандартном трис-глициновомбуфере в течение 30 минут.

Для окраски антителами мембрану предварительноблокировали в 5% обезжиренном молоке в TBST-буфере (состав раствора 50 мMTris pH=7,4, 150 мM NaCl, 0,1% Tween 20) в течение часа и окрашивалипервичными антителами согласно рекомендациям производителя (см. ниже).- 48 -Послеотмывки,мембрануокрашиваливторичнымиантителами,коньюгированными с HRP (Sigma-Aldrich, Германия). Детекцию пероксидазнойактивности осуществляли с помощью набора реактивов Western Lightning ECLPlus (Perkin Elmer, США).В работе использовались антитела к следующим белкам: S1R (1:200, SantaCruz, США), MBP (1:10000, NEB, США), calreticulin (1:500, Cell Signalling, США),IP3R3 (1:500, Cell Signalling, США), TOM20 (1:1000, Santa Cruz, США), tubulin(1:2000, Sigma-Aldrich, США), STIM1 (1:500, Santa-Cruz, США), DARPP32 (1:500,Cell Signalling, США).2.3 Определение кристаллической структуры MBP-Atxn3-C2.3.1 Кристаллизация MBP-Atxn3-C и получение дифракционных данныхСконцентрированный белок (10 мг/мл) был закристаллизован методомдиффузии водяных паров в модификации «висячая капля».

Одиночныекристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, были получены вследующих условиях: 25% монометиловый эфир полиэтиленгликоля (5K), 1,0 Mацетат натрия, 0,1 M имидазол pH=8,0, 0,1 M ацетат цинка (кристалл C1) and 24%монометиловый эфир полиэтиленгликоля (5K), 0,9 M ацетат натрия, 0,06 Mимидазол pH=8,0, 0,1 M ацетат цинка (кристалл C2). Кристаллы были замороженыв жидком азоте, сбор дифракционных данных осуществляли на линии 19 IDсинхротрона Advanced Photon Source (Аргонн, США). Первичную обработкудифракционных изображений проводили в программе HKL2000 [187]. На этомэтапе осуществлялся поиск дифракционных максимумов hkl и определениесингониииинтегрированияпараметровопределялиэлементарнойинтегральнуюячейкикристаллов.интенсивностьНаэтапедифракционныхмаксимумов на дифрактограммах.

На этапе шкалирования интенсивностиприводили к абсолютной шкале и рассчитывали модули структурных факторовFhkl .- 49 -2.3.2. Расчет фаз, построение и уточнение модели атаксина-3В общем случае, для расчета распределения электронной плотности ( x, y, z ) в элементарной ячейке кристалла требуется знание как амплитуд Fhkl ,так и фаз hkl структурных факторов: ( x, y, z )   Fhkl exp(ihkl )exp(2 i(hx  ky  lz )) - (1) уравнениеh , k ,lэлектронной плотности, где h,k,l – Миллеровские индексы.Для определения положения поисковой молекулы в элементарной ячейкекристалла в методе молекулярного замещения используют поиск в пространствеПаттерсона.Вданнойработеопределениефазосуществлялиметодоммолекулярного замещения с использованием 40 структур MBP в качественачальных моделей в программе Phaser [188].

Карты Паттерсона представляютсобой карты межатомных векторов молекулы и могут быть рассчитаны по однимлишь амплитудам структурных факторов:P(u, v, w) 12 Fhkl cos 2 (hu  kv  lw) - (2) синтез ПаттерсонаV h , k ,lМаксимумы на картах Паттерсона соответствуют межатомным векторам.Правильное положение молекулы в элементарной ячейке кристалла соответствуетмаксимальному перекрыванию функций для поисковой и искомой структур. Напрактике, проблему поиска разбивают два этапа: вращение и трансляциюмолекулы в элементарной ячейке кристалла, отсекая межатомные вектора подлине.

Короткие вектора соответствует внутримолекулярным межатомнымвекторам, а длинные – межмолекулярным. Параметр отсечки подбираетсяэкспериментально и, как правило, составляет от 40 до 70% диаметра молекулы.Функция вращения описывается следующим образом:Rot ( R)   Pobs (u)  Pcalc ( R  u)d 3u - (3) где(V )Pobs (u) - функция Паттерсона для экспериментального набора данных,Pcalc ( R  u) - функция Паттерсона для поисковой модели, R - матрица вращения,- 50 -u = (u,v,w) . На практике в большинстве программ используется так называемаябыстрая функция вращения, где углы вращения параметризованы [188, 189].Поиск считали успешным, когда соотношение сигнал:шум для функции вращения(Z-score) превышал 7 стандартных отклонений.На втором этапе осуществляется трансляционный поиск в элементарнойячейке кристалла:Tr (T )   Pobs (r )  Pcalc (r - T)d 3r - (4) функция трансляции(V )T - вектор переноса (трансляции).

Функция трансляции показывает,насколько подобны экспериментально наблюдаемые и вычисленные картыПаттерсона во всей Паттерсоновской элементарной ячейке.Помимо этого, на этапе поиска рассчитывается R-фактор, показывающий,насколько расходятся между собой определенные и вычисленные для моделиамплитуды структурных факторов:calcobs Fhkl - FhklR factor = h,k,lFh,k,l- (5) уравнение для расчета R-фактораcalchklПосле определения фаз становится возможным расчет распределенияэлектронной плотности по формуле (1).

Помимо этого, на каждом этапеперестроения и уточнения модели рассчитывается дифференциальная картаэлектронной плотности, которая используется для выявления ошибок модели:Δρ(x, y,z)=1  Fobs - Fcalc  expiφcalc × exp(-2πi(hx + ky +lz)) - (6)V h,k,lдифференциальная карта электронной плотности.Для расчета исключенных (OMIT) карт электронной плотности в расчет невключаются атомы участка, для которого рассчитывается распределение [190].Модели были построены вручную независимо для каждого из кристаллов идля каждой молекулы в составе элементарной ячейки кристалла (в случае- 51 -кристалла С2) в программе Coot [191].

Первоначально была построенаполиаланиновая модель, после чего были добавлены боковые цепи а.к.о.На этапе уточнения стуктуры такие параметры, как координаты атомов,занятости, тепловые B-факторы варьируются с целью достижения максимальногосоответствиямеждуэкспериментальнойирасчетнойдифракционнымикартинами. Количественной мерой этого соответствия является R-фактор (5). Вдополнение, рассчитывался так называемый «свободный» R-фактор для тестовогонабора в 5 % отражений [192].При уточнении структуры использовалисьизотропные тепловые B-факторы, разбитые по группам TLS (по 10 групп вкаждой макромолекуле, определенные c помощью сервера TLS) [193].

Характеристики

Список файлов диссертации