Диссертация (1144259), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Упаковка молекул в кристалле C1.- 67 Табл. 1. Кристаллографические данные, параметры съемки кристаллов, статистическиехарактеристики уточнения кристаллических структурКристалл C2Кристалл С1(PDB: 4WTH)(PDB: 4YS9)Сбор дифракционных данныхСинхротрон APS, линия 19 ID (Аргонн, США)0.9795100Quantum 315rP1P41ИсточникДлина волны (Å)Температура (K)ДетекторПространственнаягруппаПараметрыэлементарной ячейкиa, b, c (Å)α, β, γ (°)Область разрешения (Å)Количествонезависимых отраженийRsymСреднее значение Ι/σΙПолнота набора (%)Избыточность набораданных49,01, 59,77, 77,7990,00, 89,99, 87,5038,74–2,25 (2,33–2,25)*3911559,68, 59,68, 135,1790,00, 90,00, 90,0037,65–2,00 (2,05–2,00)*318610,047 (0,917)15,7 (1,2)94,0 (76,1)1,9 (1,8)0,053 (0,566)23,2 (1,2)85,2 (58,0)1,9 (1,3)Уточнение структурыОбласть разрешения (Å) 38,74–2,25 (2,33–2,25)Количество отражений, 37158 (2105)общий набор данныхКоличество отражений, 1980 (113)тестовый набор данныхR0,202 (0,541)Rfree0,249 (0,591)Количествоневодородных атомовБелка6295Лиганда/ионов7 (Zn), 46 (MAL)Воды155Средние тепловые Bфакторы (Å2)Белка44,7Лиганда/ионов61,7 (Zn), 33,4 (MAL)Воды40,0Среднеквадратичныеотклонения37,65–2,00 (2,05–2,00)30210 (2205)1607 (124)0,207 (0,221)0,225 (0,327)29754 (Zn), 23 (MAL)9045,459,8 (Zn), 30,5 (MAL)39,4- 68 Продолжение табл.
1Длин связей (Å)0,0070,006Углов связей (°)1,1311,043Статистика РамачадранаНаиболее98,1296,60предпочтительнаяобласть (%)Разрешенная область1,752,88(%)Запрещенная область0,130,52(%)* - значения в скобках соответствуют сфере наиболее высокого разрешенияСтруктура участка Atxn3-C в кристалле C1 приведена на рис. 8 A. Этотфрагмент белка является обращенным в растворитель и семь первых остатков(S371-R377) формируют два поворота альфа-спирали. Для остального участкабелка достоверная модель не может быть построена, что обусловлено отсутствиемэлектронной плотности в соответствующей области.
Подобное отсутствиеэлектронной плотности наблюдалось при решении структуры хантингтина иможет указывать на конформационную нестабильность этой части белковоймолекулы [54, 55].В отличие от кристаллов С1, регион Atxn3-C в кристалле С2 частичноэкранирован от растворителя симметрично-связанными молекулами MBP (x-1, y,z) и (x-1, y, z-1) (рис. 8 Б).
Аминокислотная последовательность Atxn3-C S371Q397 в обеих молекулах ассиметрической единицы находится в конформацииальфа-спирали (рис. 8 Б). Кристаллическая структура этого региона былаопределена с разрешением 2.2 Å. Альфа-спираль Atxn3-C формирует рядгидрофильных взаимодействий с рядом расположенной молекулой MBP. Этивзаимодействия включают как фланкирующую последовательность, так исобственно полиглутаминовый тракт. Остатки R377 и R378 формируют полярныеконтакты с остатками E322, E308 и Y90; остатки E379 и E383 вовлечены вкоординационные связи с ионом цинка, а остатки S371 и E372 формируютводородные связи с остатком Q335 через координированные молекулы воды (рис.8 В).- 69 -Рис.
8. Структуры Atxn3-C в кристаллах С1 и С2 и структура N-концевой фланкирующейпоследовательности в кристалле С2. А. Структура Atxn3-C в кристалле С1. Короткая Nконцевая спиральная последовательность показана зеленым. Мальтозо-связывающий белокMBP показан в виде поверхности серого цвета. Б. Структура Atxn3-C в кристалле С2. Nконцевая фланкирующая последовательность – зеленым, полиГ тракт – оранжевым, С-концеваяфланкирующая последовательность – синим.
Две молекулы MBP показаны в виде поверхностейсерого цвета. В. N-концевая фланкирующая последовательность атаксина-3 показана зеленымцветом. Аминокислотные остатки MBP показаны серым цветом. Полярные взаимодействияпоказаны как пунктирные линии черного цвета и остатки, вовлеченные в данныевзаимодействия, обозначены соответствующими цветами. Карты электронной плотности дляAtxn3-C показаны в виде синей изоповерхности (порог отсечки 1 σ). Молекулы воды показаныголубым цветом. Левая и правая часть рисунка представляют собой два боковых вида сразницей в 120°.3.1.4 Структура полиглутаминовой спирали3.1.4.1 Межмолекулярные взаимодействия полиГ спирали атаксина-3Боковые цепи аминокислотных остатков глутамина в составе региона полиГформируют водородные связи с различными партнерами. В том числе, некоторые- 70 -остатки взаимодействуют со симметрически-связанной молекулой MBP (рис. 9 Г,Д, Е, Ж).
Эти взаимодействия включают в себя остатки Q387, Q389, Q390, Q392,Q393, и Q394 и, по большей части, являются взаимодействиями с заряженнымиостаткамиMBP:глутаминовойкарбоксильнымикислотыMBPгруппамиостатков(Q387(NE2)-E22(OE2),аспарагиновойиQ389(NE2)-D95(OD2),Q394(NE2)-D236(OD2)) и аминогруппой лизина (Q390 (OE2)-K295(NZ)) (рис.
9 Г,Д, Е, Ж). Помимо этого, было обнаружено взаимодействие боковой цепи остаткаQ392 с менее полярной гидроксильной группой тирозина Y176. (Q392(O)Y176(OH)) (рис. 9 Г). Аминогруппы глутамина также взаимодействовали скарбоксильными группами полипептидного остова (Q390(NE2)-D296(O)/K295(O); Q393(NE2)-T237(O)) (рис. 9 Г, Д). Некоторые остатки глутамина формируютводородные связи с координированными молекулами воды (Q391, Q392, Q385,Q386).- 71 -Рис. 9.
Структура полиГ спирали в кристалле С2. Участок полиГ в составе MBPAtxn3-C показан оранжевым цветом в ленточном представлении. Боковые цепи а.к.о. показаныкак палочки. N-концевая фланкирующая последовательность показана зеленым, а остатки MBP– серым цветом. Координированные молекулы воды показаны голубым цветом.Межмолекулярные водородные связи показаны черными пунктирными линиями.Внутримолекулярные водородные связи показаны красными пунктирными линиями. Картыэлектронной плотности 2Fo-Fc для Atxn3-C показаны в виде синей изоповерхности (пороготсечки 1 σ). На верхней панели структура повернута на 180° относительно нижней панели. Накрасных вкладках детально показаны внутриспиральные взаимодействия между остаткамиглутамина А (с соответствующей OMIT картой электронной плотности с порогом отсечки 0.9σ): (А) Y381–Q385–K388; (Б) Q387–Q391 и Q390–Q394; (В) Q386–Q389–Q393–Q397.
На синихвкладках детально показаны межмолекулярные взаимодействия между остатками глутамина (ввиде оранжевых палочек) и остатками MBP (в виде серых палочек) с соответствующей OMITкартой электронной плотности с порогом отсечки 0.9 σ: (Г) Q392–Y176, Q393–T237, Q387–E22;(Д) Q390–K295/K295/D296; (Е) Q394–D236; и (Ж) Q389–D95.- 72 -3.1.4.2 Внутримолекулярные взаимодействия полиГ спирали атаксина-3Наиболее интересные данные о структуре полиГ спирали были получены,пожалуй, при анализе внутримолекулярных взаимодействий между остаткамиглутамина.Альфа-спиральнаяконформациядополнительноAtxn3-Cстабилизирована внутримолекулярными водородными связями, формируемымимежду боковыми цепями глутамина (рис. 9 и вкладки А, Б, В, рис.
10 А, а такжетабл. 2). Восемь из 13 остатков вовлечены в формирование прямыхвнутриспиральных водородных связей между i и i+4 остатком (в четырех случаях)и i и i+3 остатком (в одном случае). Помимо этих прямых взаимодействий междуостатками глутамина, остаток Q385 взаимодействует с неглутаминовым остаткомi-4 (Y381) и i+3 K388 через водородные связи с координированной молекулойводы.ЛишьодиностатокQ392невовлеченвовнутриспиральныевзаимодействия, взаимодействуя с Y175 MBP. Направления большинстваводородных связей ориентированы параллельно оси альфа-спирали.Табл.
2. Внутриспиральные водородные связи между остатками глутаминав регионе полиГАминокислотный Аминокислотныйстаток 1остаток 2Y381 (OH)Q385 (OE1)Q385 (NE2)K388 (NZ)Q387 (NE2)Q386 (NE2)Q389 (NE2)Q393 (NE2)Q390 (NE2)Q391 (OE1)Q389 (OE1)Q393 (OE1)Q397 (OE1)Q394 (OE1)Расстояние, ÅY381…HOH; 2.6HOH…Q385; 2.8Q385…HOH; 2.9HOH…K388; 2.83.52.92.74.03.0В двух молекулах ассиметрической единицы кристалла C2 боковые цепиглутамина имеют похожие, но слегка отличные конформации. Основное отличиесостоит в том, что водородная связь между остатками Q394-Q397 необнаруживается в одной из молекул. Для того, чтобы подтвердить построеннуюмодель, были рассчитаны исключенные карты электронной плотности (атомыбоковых цепей глутамина были исключены при расчете распределенияэлектронной плотности) (рис.
10 А). Помимо этого, был рассчитан локальный- 73 -коэффициент корреляции в прямом пространстве для атомов аминокислотногоостова и боковых цепей (рис. 10 Б), а также тепловые B-факторы для атомовполипептидного остова и боковых цепей аминокислот. Для всех а.к.о. региона,предшествующего полиГ и собственно полиглутаминового тракта поостатчныйККПП был выше 0,85 (синяя пороговая линия на рис. 10 Б), что указывает на то,что построенная модель является достоверной.Табл. 3. Локальные коэффициенты корреляции в области полиГ для кристалла С2А.к.о.A370S371E372E373L374R375K376R377R378E379A380Y381F382E383K384Значениелокальногокоэффициентакорреляциивпрямомпространстве (ККППi)0,970,950,960,920,970,950,940,940,960,950,960,970,970,970,96А.к.о.Q385Q386Q387K388Q389Q390Q391Q392Q393Q394Q395Q396Q397G398D399Значениелокальногокоэффициентакорреляции в прямомпространстве (ККППi)0,970,960,970,950,960,950,940,930,940,930,910,910,890,150,15Построенная модель хорошо согласуется с экспериментальными данными,за исключением остатков Q390 и Q394, для которых разрешение оказалось ниже,чем для остальной части альфа-спирали.
Средние тепловые B-факторы дляотдельных остатков в регионе полиГ были выше, чем для белка в целом (рис.10 Б), однако, не превышали последний более, чем в полтора раза (Q396) (краснаяпороговая линия на рис 10 Б). Начиная с G398 B-факторы в несколько разпревышали среднее значение, что свидетельствует о разупорядоченности вследующей за полиГ области полипептидной цепи.- 74 -Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
