Диссертация (1144259)
Текст из файла
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕАВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ"САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТПЕТРА ВЕЛИКОГО"На правах рукописиЖЕМКОВВладимир АндреевичСТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БЕЛКОВ, ВОВЛЕЧЁННЫХ ВНЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕОСОБЕННОСТИ ИХ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙСпециальность 03.01.02 – БиофизикаДиссертация на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукНаучный руководитель:д.б.н. Безпрозванный И.Б.Санкт-Петербург2018-2-ОГЛАВЛЕНИЕОГЛАВЛЕНИЕ ................................................................................................. - 2 ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................
- 6 Актуальность работы ...............................................................................................- 6 Цель и задачи исследования ...................................................................................- 9 Основные положения, выносимые на защиту.....................................................- 10 Научная новизна работы .......................................................................................- 10 Научно-практическое значение работы ...............................................................- 11 Методология и методы исследования ..................................................................- 12 Личный вклад автора .............................................................................................- 13 Апробация работы..................................................................................................- 13 Объем и структура диссертации.
..........................................................................- 14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ..... - 16 1.1. Структурно-функциональная характеристика атаксина-3 .........................- 16 1.1.1 Полиглутаминовые заболевания и спинномозжечковая атаксия 3-го типа 16 1.1.2 Структура и функция атаксина-3 .............................................................- 17 1.1.3 Участие атаксина-3 в развитии СМА 3 ...................................................- 18 1.1.4 Структура и функция полиглутаминовых последовательностей .........- 20 1.1.5 Методы установления структуры белков.
Рентгеноструктурный анализ. . 20 1.2 Структурно-функциональная характеристика хантингтина .......................- 23 1.2.1 Общая характеристика болезни Хантингтона ........................................- 23 1.2.2 Структура и функция хантингтина ..........................................................- 24 1.2.3 Подходы к разработке лигандов, предотвращающих внутриклеточнуюагрегацию хантингтина ......................................................................................- 27 1.2.4 Пептоиды – новый класс соединений-пептидомиметиков....................- 28 1.3. Структурно-функциональная характеристика рецептора сигма-1 ............- 30 1.3.1 Рецептор сигма-1 - плюрипотентный модулятор внутриклеточнойсигнализации .......................................................................................................- 30 1.3.2 Структурная организация рецептора сигма-1 .........................................- 31 1.3.3 Механизм функционирования рецептора сигма-1 .................................- 32 1.3.4 Биофизические подходы для изучения мембранных белков ................- 33 1.3.4.1 Липидный состав биологических мембран ......................................- 34 --3-1.3.4.2 Латеральная ассиметрия, фазовый состав клеточных мембран ирафтовые микродомены .................................................................................- 36 1.3.4.3 Рафты в эндоплазматическом ретикулуме .......................................- 38 1.3.5 «Гигантские» одномембранные липосомы как биофизическая модельклеточных мембран.............................................................................................- 39 ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................... - 41 2.1 Генетические конструкции .............................................................................- 41 2.1.1 Выделение и анализ плазмидных ДНК....................................................- 42 2.1.2 Молекулярное клонирование....................................................................- 42 2.1.3 Сайт-направленный мутагенез .................................................................- 42 2.2 Экспрессия, очистка и анализ рекомбинантных белков ..............................- 43 2.2.1 Экспрессия и очистка белков в экспрессионной системе E. coli ..........- 43 2.2.2 Экспрессия и очистка белков в бакуловирусной системе экспрессии .- 44 2.2.3 Разделение белков в ПААГ и иммуноблоттинг (вестерн-блот анализ) . - 472.3 Определение кристаллической структуры MBP-Atxn3-C ...........................- 48 2.3.1 Кристаллизация MBP-Atxn3-C и получение дифракционных данных - 48 2.3.2.
Расчет фаз, построение и уточнение модели атаксина-3 ......................- 49 2.3.3 Валидация структуры полиГ тракта атаксина-3 .....................................- 51 2.4 Идентификация пептоида HNP1.....................................................................- 52 2.4.1 Синтез пептоидной библиотеки ...............................................................- 52 2.4.2 Скрининг пептоидной библиотеки ..........................................................- 53 2.4.3 Идентификация пептоидов и их синтез ...................................................- 54 2.4.4 Определение константы связывания HNP1-N17 ....................................- 55 2.5 Культивирование клеток .................................................................................- 55 2.5.1 Клеточные культуры..................................................................................- 55 2.5.2 Условия культивирования.........................................................................- 55 2.5.3 Получение первичных культур нейронов ...............................................- 55 2.5.4 Трансфекция клеточных линий ................................................................- 56 2.5.5 Иммунофлуоресцентная микроскопия ....................................................- 57 2.5.6 Биохимическое фракционирование органелл .........................................- 58 2.6 Изучение белок-липидных взаимодействий .................................................- 59 2.6.1 Pull-Down с холестерин-агарозой.............................................................- 59 2.6.2 Липосомный Pull-Down .............................................................................- 60 2.7 Исследования рецептора сигма-1 в «гигантских» одномембранныхлипосомах ...............................................................................................................- 60 --4-2.7.1 Липиды ........................................................................................................- 60 2.7.2 Получение протеолипосом........................................................................- 60 2.7.3 Получение «гигантских» одномембранных липосом (ГОЛ).................- 61 2.7.4.
Измерение коэффициентов диффузии мембранных липидов ..............- 61 2.8 Электронная микроскопия ..............................................................................- 62 2.9 Статистические тесты оценки достоверности ..............................................- 62 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ............................................................................. - 63 3.1 Кристаллическая структура С-концевого фрагмента белка атаксина-3 ...- 63 3.1.1 Выделение, очистка и кристаллизация белка слияния MBP-Atxn3-C .- 63 3.1.2. Построение и уточнение кристаллической структуры MBP-Atxn3-C . - 653.1.3 Кристаллическая структура карбокси-концевого участка атаксина-3(Atxn3-C) ..............................................................................................................- 66 3.1.4 Структура полиглутаминовой спирали ...................................................- 69 3.1.4.1 Межмолекулярные взаимодействия полиГ спирали атаксина-3 ...- 69 3.1.4.2 Внутримолекулярные взаимодействия полиГ спирали атаксина-3 - 723.1.5 Заключение .................................................................................................- 74 3.2 Нейропротекторные свойства пептоида HNP1 .............................................- 76 3.2.1 Идентификация пептоида HNP1 из многомерной пептоидной библиотекив качестве лиганда для амино-концевого участка хантингтина N17 ............- 76 3.2.3 N17-связывающий пептоид HNP1 ингибирует агрегацию мутантногохантингтина в клеточной модели in vitro .........................................................- 79 3.2.4 N17-связывающий пептоид HNP1 предотвращает потерю синаптическихконтактов в клеточной модели болезни Хантингтона ....................................- 80 3.2.5 Заключение .................................................................................................- 82 3.3 Белок-липидные взаимодействия рецептора сигма-1 ..................................- 83 3.3.1 Выделение и очистка рекомбинантного рецептора сигма-1 человека .- 83 3.3.2 Рецептор сигма-1 взаимодействует с компонентами липидных рафтов:холестерином и сфингомиелинами ...................................................................- 85 3.3.3 Реконструкция рецептора сигма-1 в липидные бислои.
Кластеризациярецептора в холестерин-содержащих липосомах ............................................- 86 3.3.4 FRAP-измерения коэффициентов диффузии мембранных липидов ....- 88 3.3.5 Рецептор сигма-1 локализуется в особых областях ЭР .........................- 90 3.3.6 Определение консенсусной последовательности связывания стеролов ицерамидов ............................................................................................................- 91 --5-3.3.7 Мутантные по сайту связывания холестерина формы рецептора сигма-1диффузно распределены в тубулах ЭР .............................................................- 92 3.3.8 Рецептор сигма-1 человека локализуется в составе мембран ЭР,ассоциированных с митохондриями .................................................................- 95 3.3.9 Сверхэкспрессия рецептора сигма-1 на клеточном уровне приводит кувеличению контактной длины между ЭР и митохондриями .......................- 97 3.3.10 Функционально активный рецептор сигма-1 необходим дляподдержания синаптических контактов в первичных гиппокампальныхкультурах нейронов in vitro................................................................................- 98 Глава 4.
ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................ - 100 4.1 Кристаллическая структура С-концевой области атаксина-3 ...................- 100 4.1.1 Общая характеристика кристаллической структуры С-концевогофрагмента атаксина-3 .......................................................................................- 100 4.1.2 Структура полиГ тракта атаксина-3: сравнение с другими структурамиполиглутамина ...................................................................................................- 100 4.1.3 Внутримолекулярные взаимодействия полиГ тракта атаксина-3.......- 103 4.1.4 Структура полиГ в контексте нейродегенеративных заболеваний ....- 104 4.2 Нейропротекторные и анти-агрегационные свойства хантингтинсвязывающего пептоида HNP1 ...........................................................................- 107 4.2.1 Структурные особенности пептоида HNP1 и предполагаемый механизмнейропротекторного действия .........................................................................- 107 4.2.2 Пептоиды как перспективные блокаторы агрегации хантингтина.....- 108 4.3 Белок-липидные взаимодействия рецептора сигма-1 человека ................- 109 4.3.1 Рецептор сигма-1 перераспределяет липиды в модельных бислойныхмембранах ..........................................................................................................- 109 4.3.2 Внутриклеточная локализация рецептора сигма-1 обусловлена наличиемхолестерин-узнающих последовательностей .................................................- 111 4.3.3 Сигма-1 рецептор как основной рафтовый организаторэндоплазматического ретикулума ...................................................................- 112 4.3.4 Модель белок-липидного модулирования ионных каналов через рецепторсигма-1.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
