Диссертация (1144259), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Показано, что вещество обладает нейропротекторнымисвойствами в клеточной кортико-стриатальной модели болезни Хантингтона. Длярецептора сигма-1 человека показано, что он способен связываться с главнымилипиднымикомпонентамирафтовыхмикродоменов:холестериномисфингомиелинами. Рецептор сигма-1 человека был впервые реконструирован вмодельные бислойные «гигантские» липосомы. Продемонстрировано, чтовстраиваниерецепторавхолестерин-содержащиебислоиприводитккластеризации рецептора и холестерина на мембране.
Идентифицирован сайтузнаванияхолестеринав составе трансмембранного домена. Приведеныэкспериментальные доказательства того, что наличие стерол-связывающегомотива отвечает за правильное позиционирование S1R в митохондриальноассоциированные области ЭР. Продемонстрировано увеличение контактнойдлины между ЭР и митохондриями при свехэкспрессии S1R человека в линиHEK293T. Показано, что функционально-активный рецептор сигма-1 необходимдля поддержания синаптических контактов в гиппокампальных культурах in vitro.Научно-практическое значение работыПредставленные данные имеют фундаментальное и практическое значение.Установленная структура полиГ тракта высокого разрешения представляет собойновыеданные,объясняющиеповедениеифолдинггомополимерныхпоследовательностей полиГ. Впервые показана эффективность применения- 12 -пептоидных молекул, связывающихся с аминоконцевой областью хантингтина, вкачестве веществ-прототипов лекарственных средств на клеточной модели БХ.Соединение HNP1 может быть в дальнейшем использовано для разработки болеевысокоспецифичныхпроизводных.Рассмотренныебелок-липидныевзаимодействия рецептора сигма-1 имеют важное значение для пониманияфундаментальных основ функционирования рецептора в клетке.
Разработаннаяметодика встраивания рецептора сигма-1 в бислойные мембраны можетиспользоваться для изучения биофизических основ модуляции белков-партнероврецептора сигма-1.Полученные в настоящей работе результаты используются в курсах лекцийкафедры«Медицинскаяфизика»ИФНиТСПбПУ:«Основырентгеноструктурного анализа белков в нейробиологии», «Прикладные проблемынейробиологии».Методология и методы исследованияВэкспериментальнойчастиработыприменялсяширокийспектрсовременных и адекватных поставленным научным задачам методик.
Дляопределения атомной структуры С-концевой области и полиГ тракта атаксина-3использовался метод рентгеноструктурного анализа белков. Для этого белок былзакристаллизован, получена рентгеновская дифракционная картина кристаллов,рассчитано распределение электронной плотности, на основании которой былапостроенаиуточненадостовернаямодельструктурыатаксина-3.Дляидентификации пептоидов, связывающихся с N-концевой областью хантингтина,была синтезирована пептоидная библиотека соединений. Для изучения белоклипидных взаимодействий рецептора сигма-1 человека был применен широкийспектр биофизических и биохимических методик, включающих, помимо прочего,выделениеифракционированиеочисткумембран,рекомбинантногорецептора,иммунофлуоресцентныйбиохимическоеанализ.Основнымподходом в данной части работы были биофизические исследование белка,- 13 -реконструированноговмодельныебислоиразличногосостава.Всевышеописанные методики являются современными и адекватными подходами вобласти молекулярной и клеточной биологии, большинство из которых быливпервые применены к объектам настоящего исследования.Личный вклад автораОсновные результаты диссертационной работы получены лично автором сиспользованиемэкспериментальнойбазыЛабораторииМолекулярнойнейродегенерации СПбПУ (Санкт-Петербург, Россия) и лаб.
И.Б. Безпрозванногов Юго-Западном медицинском центре Университета Техаса (UTSW MedicalCenter, Даллас, США). Планирование экспериментов и обсуждение полученныхрезультатов проводилось совместно с научными руководителями: д.б.н. И.Б.Безпрозванным и Dr. MeeWhi Kim. Автор принимал непосредственное участие ввыполнении представленных в работе экспериментов, если не указано обратное:эксперименты на нейрональных культурах были выполнены асп. ЛМНН.А. Красковской и сотрудником Юго-Западного Медицинского центра Dr.
DanielRyskamp. Пептоидная библиотека была синтезирована сотрудником СПбГУ к.х.н.П.Р. Голубевым. Эксперименты по кристаллизации MBP-Atxn3-C проводилисьсовместно с Dr. MeeWhi Kim. Сбор дифракционных данных осуществлялся приподдержке сотрудников лаборатории структурной биологии UTSW Medical Centerи синхротрона Advanced Photon Source (Аргонн, США). Обработка данных,подготовка результатов к публикациям проводилась лично автором, текстыпубликаций подготавливались совместно с соавторами.Апробация работыРезультаты диссертационной работы были представлены на следующихроссийских и международных конференциях: 18-й международной конференции,посвященной кальций-связывающим белкам и функции кальция в норме и припатологии (The 18th International Conference on Calcium Binding Proteins andCalcium Function in Health and Disease, 30 июня-4 июля 2013 г, г.
Кируна,- 14 -Швеция), Всероссийской конференции «Системно-технические решения проблемвизуализации в нейродегенерации» (23-25 октября 2013 г, г. Санкт-Петербург,Россия), XLII научно-практической конференции с международным участием«Неделя науки СПбГПУ» (2-7 декабря 2013 г, г. Санкт-Петербург, Россия),конференции «Кальций-2014: от фундаментальный основ до клиники» (Calcium2014: From basics to bedside, 3-5 июля 2014 г, г. Стокгольм, Швеция), совместномсеминаре Лаборатории молекулярной нейродегенерации и лаборатории А.
Аперии(Aperia-Brismar-Bezprozvanny Lab Meeting, 3 июля 2014 г., КаролинскийИнститут, г. Стокгольм, Швеция), Международной научной конференции «Наукабудущего» (Science of the Future, 17-20 сентября 2014 г, г. Санкт-Петербург,Россия), XVII Зимней молодежной школе ПИЯФ по биофизике и молекулярнойбиологии (29 февраля-5 марта 2015, п. Рощино, Россия), 12-й международнойконференции, посвященной болезням Альцгеймера и Паркинсона (The 12thInternational Conference on Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases, 18-22 марта 2015г, г. Ницца, Франция),V съезде биофизиков России (4-10 октября 2015 г, Ростовна-Дону, Россия), II Конференции молодых ученых и специалистов ПИЯФ«КМУС-2015» (11-13 ноября 2015, г.
Гатчина, Россия), Форуме с международнымучастием «XLIV Неделя Науки СПбПУ» (30 ноября-5 декабря 2015 г, СанктПетербург, Россия), Гордоновской научной конференции «Нейробиологиязаболеваний мозга» (Gordon Research Conferences: Neurobiology of Brain Disorders,7-12 августа 2016 г, г. Жирона, Испания), Форуме с международным участием«XLV Неделя Науки СПбПУ» (14-19 ноября 2016 г., г.
Санкт-Петербург, Россия).Основные результаты по теме диссертационной работы опубликованы двухнаучных статьях в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, а также вматериалах научных конференций (16 тезисов).Объем и структура диссертации.Диссертационнаяработасостоитизвведения,обзоралитературы,экспериментальной части, включающей методологическую часть и результаты- 15 -исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов исписка литературы, включающего 276 источников.
Работа изложена на 147 листахмашинописного текста, включает 26 рисунков и 3 таблицы.- 16 -ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ1.1. Структурно-функциональная характеристика атаксина-31.1.1 Полиглутаминовые заболевания и спинномозжечковая атаксия 3-готипаБолезньМачадо-Джозефа,типа(СМА 3),представляетилисобойспиномозжечковаянаследственноеатаксия3-гоаутосомно-доминантноезаболевание, которое генетически обусловлено экспансией триплета CAG вкодирующей части гена ATXN3 [1].
К болезням экспансии триплета CAG относятгруппу заболеваний, каждое из которых на молекулярном уровне обсловленоувеличениемчислаCAG-повтороввышекритическойдлинывгенахсоответствующих белков. На белковом уровне это проявляется в увеличениичисла остатков глутамина в полипептидной цепи. В настоящее время известныдевятьзаболеваний:спинобульбарнаяболезньмышечнаяХантингтонаатрофия(белок(андрогеновыйхантингтин-Htt),рецептор-AR),денторубропаллидольюисова атрофия (атрофин-1 – Atn1), спиномозжечковаяатаксия (СМА) 1-го типа (атаксин-1 – Atxn1), СМА 2 (атаксин-2 – Atxn2), СМА 3(атаксин-3 – Atxn3), СМА 6 (субъединица α1А потенциал-зависимого кальциевогоканала – CacnA1A), СМА 7 (атаксин-7 – Atxn7), СМА 17 (ТАТА-бокссвязывающий белок – TBP) [2-4].
Для каждого из белков существует критическаядлина полиглутаминового тракта (полиГ), свыше которой проявляются симптомызаболевания [5].Всезаболеванияэкспансиитриплетанаследуютсяпоаутосомно-доминантному типу и на белковом уровне проявляются, преимущественно, в виденакопленияфрагментовполиглутамин-содержащихбелков.Внейронахнакопление полиглутамин-содержащих агрегатов приводит клеточной гибели иразвитию симптомов соответствующего заболевания.Спиномозжечковая атаксия 3-го типа является наиболее часто встречаемойиз доминантно-наследуемых атаксий и вторым по частоте встречаемостизаболеванием после болезни Хантингтона.- 17 -1.1.2 Структура и функция атаксина-3Атаксин-3 представляет собой консервативный мультидоменный белокмолекулярной массой в 42 кДа и относится к семейству деубиквитиназ [1, 6].Атаксин-3 содержит следующие фрагменты: N-концевой джозефин-домен JD (1198 а.к.о.), промежуточный линкер, содержащий убиквитин-связывающие мотивыUIM1 и UIM2 (223-263 а.к.о.), а также С-концевой участок, содержащийполиглутаминовую последовательность (начиная с 292 а.к.о.) и дополнительныйубиквитин-связывающий мотив UIM3 (рис.
1) [1, 6]. Структуры джозефин-домена(JD) были определены методами кристаллографии и ЯМР [7-10]. СтруктураUIM1-UIM2 участка была определена методом ЯМР [11]. Структура полиГ трактаатаксина-3 не определена с атомным разрешением на настоящий момент, нометодом ЯМР было показано, что, по большей части, С-концевой фрагментразупорядочен [12]. Джозефин-домен является каталитическим доменом ипредставляет собой структуру, подобную цистеиновым протеазам и имеет двецентральныепредставляютповерхности,собойсвязывающиеубиквитинвысококонсервативные[7-10].короткиеUIM-доменыальфа-спиральныепоследовательности, связывающие, в случае атаксина-3, полиубиквитин, но немоно- или диубиквитин [11].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
