Диссертация (1144259), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Связь с нейродегенеративными заболеваниями .............................- 114 ВЫВОДЫ ....................................................................................................... - 117 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................ - 119 СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .............................................
- 120 БЛАГОДАРНОСТИ ..................................................................................... - 121 ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................... - 123 СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ ..................................... - 126 --6-ВВЕДЕНИЕАктуальность работыНейродегенеративные заболевания (НДЗ) представляют собой совокупностьразличных по своей природе болезней ЦНС, поражающих различные отделыголовного мозга. Манифестация НДЗ происходит, как правило (за исключениемредких ювенильных форм), в зрелом возрасте и на клеточном уровне связана снейрональной клеточной гибелью и дегенерацией отдельных структур головногомозга.
Многие наследственные НДЗ относят к так называемым конформационнымболезням - группе дегенеративных заболеваний, в основе которых лежитнарушение трехмерной пространственной укладки определенных белковыхмолекул, которое сопровождается изменением конформации белков. Несмотря намноголетние исследования механизмов различных НДЗ, таких как болезниАльцгеймера, Хантингтона, Паркинсона, и поиск эффективных терапевтическихподходов, подавляющее большинство из них остаются неизлечимыми, апациентам может быть предложено только симптоматическое лечение.
Остаютсяплохо изученными структурные особенности и молекулярные механизмыфункционирования и активации как нормальных, так и мутантных форм белков,вовлеченных в нейродегенеративные процессы. Известно, что многие белки,вовлеченные в конформационные заболевания, формируют внутриклеточныеагрегаты (гомополимеры) и/или аберрантные взаимодействия с другимимакромолекулами (белками, ДНК, липидными мембранами).
Для максимальнополного понимания механизмов функционирования подобных белков, лежащих восновемолекулярногопатогенезазаболеваний,необходимоприменениекомплексных исследований, сочетающих биофизические, биохимические иструктурные подходы.Примером такого научного исследования может служить данная работа, гдев качестве объектов для изучения были выбраны следующие белки: атаксин-3,хантингтин и рецептор сигма-1.-7-Атаксин-3 (ataxin-3, atxn3), экспансия в гене ATXN3 которого приводит квозникновению спиномозжечковой атаксии 3-го типа, относится к белкам,содержащим гомополимерные полиглутаминовые последовательности (полиГ).Атаксин-3 является мультидоменным белком, состоящим из N-концевой областипредставленной каталитическим Джозефин-доменом, нескольких тандемныхубиквтин-связывающихполиглутаминовыйсвязывающихповторовтракт.мотивовиСтруктурыбылиранееС-концевойобласти,Джозефин-доменаопределенысисодержащейубиквитин-помощьюметодоврентгеноструктурного анализа (РСА) и ЯМР, в то же время, структура С-концевойобласти не была ранее определена.
Более того, имеющаяся до настоящегомоментаточнаяструктурнаяинформацияополиГпоследовательностиограничена лишь кристаллическими структурами первого экзона хантингтина(Htt) с 17 и 36 повторами глутамина, а также кристаллической структурой 10Голигопептида в комплексе с анти-полиГ антителом. Однако, структура первогоэкзона хантингтина была определена с разрешением лишь 3.0 – 3.6 Å и осложненаналичием множественных конформаций полиГ в кристалле, что затруднилоопределение положений боковых цепей аминокислотных остатков. Такимобразом, важным направлением структурных исследований белков, содержащихполиГ последовательности, является определение кристаллической структурыполиГ.Хантингтин (Htt), является, пожалуй, одним из наиболее детальноохарактеризованных, со структурной точки зрения, белков, вовлеченных впроцессы НДЗ.
Мутации экспансии триплета в гене хантингтина приводят кразвитию болезни Хантингтона (БХ). Структура полноразмерного хантингтинабыла определена метом криоэлектронной микроскопии, а структуры первогоэкзона – с помощью РСА. Ряд структурных и биофизических работ, объектомисследования которых служил первый экзон хантингтина, продемонстрировали,чтополиглутаминифланкирующиеегопоследовательностиоказываютреципрокное влияние друг на друга: фланкирующие домены модулируют-8-структуру полиГ тракта, его способность к агрегации и цитотоксичность. Вчастности,ранеенепосредственнобылопоказано,предшествующаячтополиГпоследовательность,N-концеваятракту(N17),являетсяпро-агрегационной.
Согласно гипотезе, амфипатическая спираль N17 хантингтинагомоолигомеризуется, что, в свою очередь, приводит к сближению и увеличениюлокальнойконцентрацииполиГипоследующейполиГ-опосредованнойагрегации. В соответствии с этим, анти- и интратела, выработанные против N17,показали свою эффективность на клеточных и мышиных моделях болезниХантингтона. Однако, терапевтическая ценность подобного подхода, вследствиебольшого молекулярного веса белковых антител, является спорной. Такимобразом,поискнебольшиххимическихсоединений,направленныхнаблокирование N17-зависимого этапа агрегации, представляется перспективнымподходом для будущей разработки веществ-прототипов лекарственных средств.Рецепторсигма-1трансмембраннымчеловекабелком(sigma-1эндоплазматическогоreceptor,S1R)ретикулума,являетсяселективносвязывающим широкий спектр соединений, известных, как сигма-лиганды.
Рядагонистов рецептора сигма-1 человека в настоящее время широко используется вклиническойпрактикедлялечениянейропсихиатрическихрасстройств.Доклинические и клинические испытания агонистов S1R показали эффективностьфармакологическойактивациирецепторавряденейродегенеративныхзаболеваний, таких как болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера. Согласнодоминирующей на настоящий момент гипотезе, S1R функционирует какрегуляторный белок, являясь дополнительным аллостерическим модуляторомширокого спектра ионных каналов и мембранных рецепторов.
Рецептор сигма-1представляется плюрипотентным модулятором, оказывая влияние на множествовнутриклеточных процессов и, в целом, является анти-апоптотическим белком вусловиях клеточного стресса. Таким образом, механизм функционирования S1Rна молекулярном уровне остается неизвестным. Отдельную интересную областьисследованийпредставляетизучениевзаимодействийS1Rслипидами-9-биологическихмембран.последовательностиНесмотрясвязываниянаS1Rранеесописанныеотдельнымивлитературетипамилипидов(холестерином и ганглиозидами), белок-липидные взаимодействия S1R ифункциональные эффекты подобного рода взаимоотношений на настоящиймомент не изучены на молекулярном уровне.Цель и задачи исследованияЦелью исследования являлось установление структурных характеристик,определяющихмежмолекулярные взаимодействиябелков,вовлеченныхвпроцессы развития нейродегенеративных заболеваний: атаксина-3, хантингтина ирецептора сигма-1 человека.Соответствующие задачи исследования:1.
С помощью метода рентгеноструктурного анализа белков установитьатомнуюкристаллическуюструктуруС-концевогополиглутамин-содержащего участка белка атаксин-3.2. Путем синтеза пептоидной библиотеки соединений разработать исинтезировать вещества, специфически связывающиеся с N-концевойобластью N17 хантингтина, а также оценить их антиагрегационные инейропротекторные свойства.3. С помощью биофизических и биохимических экспериментов исследоватьбелок-липидныевзаимодействиясигма-1рецептора,атакжеидентифицировать отвечающие за них структурные особенности белковоймолекулы.4.Определитьфункциональнуюзначимостьбелок-липидныхвзаимодействий рецептора сигма-1 в клетках линии HEK293T и первичныхкультурах нейронов.- 10 -Основные положения, выносимые на защитуНа защиту выносятся следующие положения:1.Полиглутаминовыйтрактбелкаатаксина-3находитсявдвухконформационных состояниях: свободной петли и альфа-спирали.
Альфаспиральнаяконформациястабилизированадвумяпротяженнымисетямиводородных связей: между атомами пептидной группы i и i+4 остатков и междукарбокси- и аминогруппами боковых цепей остатков глутамина; при этомводородные связи между боковыми цепями ориентированы параллельно осиальфа-спирали.2. Пептоидное соединение HNP1 специфически связывается с аминоконцевойобластью(N17)хантингтина.ПептоидноесоединениеHNP1предотвращает амилоидогенную агрегацию хантингтина in vitro и являетсянейропротектором в модели болезни Хантингтона.3.Рекомбинантныйрецепторсигма-1человекакластеризуетсянаповерхности холестерин-содержащих липосом.4.
Сверхэкспрессия рецептора S1R, локализующегося в митохондрийассоциированных мембранах, в клеточной линии HEK293T приводит кувеличению контактной длины между эндоплазматическим ретикулумом имитохондриями. Замены аминокислотных остатков в холестерин-связывающейCARC-последовательностирецепторавклетке.приводяткнеправильномуФункционально-активныйпозиционированиюрецепторнеобходимдляподдержания синаптических контактов в модельных гиппокампальных культурахнейронов in vitro.Научная новизна работыВпервые установлена кристаллическая структура С-концевой областиатаксина-3 и полиглутаминового тракта с наиболее высоким на данный момент- 11 -разрешением 2.2 Å. Показано, что полиГ тракт атаксина-3 может существовать вдвух конформациях: свободной петли и альфа-спирали., при этом, уникальнойструктурной особенностью альфа-конформации полиГ является наличие двухсетей водородных связей (между атомами полипептидного остова и междубоковымицепямиаминокислотныхостатков).Синтезированабиблиотекапептоидных соединений и идентифицировано пептоитоидное соединение HNP1,специфически связывающееся с амино-концевой областью (N17) хантингтина.Продемонстрировано, что вещество HNP1 обладает анти-агрегационнымисвойствами in vitro, подавляя агрегацию белка слияния Htt-82Q-GFP в клеткахлинии HEK239T.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
