Диссертация (1144259), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Домен N17 состоит из 17аминокислотных остатков (1-17 а.к.о.), высококонсервативен среди всехпозвоночных , и, судя по имеющимся в литературе данным, играет ключевую- 28 -роль в определении функции белка хантингтина [66, 67]. Домен N17 подвергаетсябольшому количеству посттрансляционных модификаций, оказывающих влияниена агрегацию mHtt in vitro [104-107]. В протеомном исследовании было выявленоболее 200 белков, связывающихся с этим доменом, что указывает на то, что онможет быть вовлечен в большое количество белок-белковых взаимодействий ичтосуществует большое количествогенов-модификаторов, потенциальноспособных влиять на агрегацию мутантного хантингтина [63].Биофизические исследования первого экзона хантингтина показали, что N17играет важную роль в изменении токсичности мутантного хантингтина.
Былопоказано, что N17 способствует агрегации мутантного хантингтина [108-111], в товремя как полиП последовательность препятствует агрегации [109, 112-114].Таким образом, гипотеза о двухстадийной агрегации хантингтина включает N17и полиГ-опосредованные этапы. На основе имеющихся сведений представляетсявесьма перспективным идентификация новых высокоэффективных лигандов камино-концевому участку N17 для предотвращения агрегации mHtt.Ранее, в качестве лигандов для N17 были выработаны анти- и интратела[115-117]. Действительно, в биофизических экспериментах белковые лигандыподавляли агрегацию мутантного хантингтина.
Однако, ввиду своей большоймолекулярной массы и низкой стабильности анти- и интратела трудно применимына практике.1.2.4 Пептоиды – новый класс соединений-пептидомиметиковВ настоящее время, разработаны химические соединения, построенные, каки природные биополимеры (белки и пептиды), по модульному принципу.Подобные вещества получили название пептидомиметиков [118]. Одним изпримеров такого рода соединений являются пептоиды (поли-N-замещеннымиглицины), обладающие рядом преимуществ по сравнению с пептидами,демонстрируя, в частности, большее структурное разнообразие по сравнению спептидами, более высокую стабильность in vivo, и более высокую мембраннуюпроницаемость.- 29 -Пептоидные библиотеки, подобно той, которая описана в настоящей работамогут служить богатым источником для поиска лигандов для широкого спектрабелков [119-121]. Размер типичных пептоидных соединений составляет 4-8остатков, что, примерно, в 20 раз меньше, чем однодоменное интратело, и в 40 разменьше, чем одноцепочечное антитело.
Меньший размер этих соединенийпредставляетсобойзначительноепреимуществодлятерапевтическогоприменения вследствие лучшей проницаемости через гемато-энцефалическийбарьер и более высокой диффузии.В предыдущих исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, былиописаны идентификация и синтез пептоидов, специфически связывающихся судлиненным полиГ трактом (пептоид HQP09) и амилоид-бета пептидом Ab42(пептоид IAM1) [122, 123]. В обоих случаях была синтезирована библиотекауникальных пептоидных соединений, а целевые белковые последовательности(полиГ тракт и Ab42) использовались для идентификации пептоидов-лигандов.HQP09 и IAM1 показали эффективность в качестве анти-агрегационных инейропротекторныхидентифицированнымиагентов,котораяанти-полиГбылаантителами,сравнимаанти-Ab42пептидом QBP1, связывающимся с полиГ трактом ) [122, 123].сранееантителамии- 30 -1.3.
Структурно-функциональная характеристика рецептора сигма-11.3.1 Рецептор сигма-1 - плюрипотентный модулятор внутриклеточнойсигнализацииСигма-рецепторы, ранее ошибочно отнесенные к опиоидным, в настоящеевремя выделены в самостоятельный класс внутриклеточных рецепторов,уникальных по своей структуре и спектру взаимодействующих лигандов [124127].
Наиболее изученным с фармакологической точки зрения является рецепторсигма-1 (S1R). Этот рецептор представляет собой небольшой интегральныймембранный белок, состоящий из 223 аминокислотных остатков, которыйпреимущественно локализуется в участках мембран эндоплазматическогоретикулума (ЭР), ассоциированных с митохондриями (МАМ) [128, 129]. S1Rявляется высококонсервативным белком млекопитающих [130].
Показано, что егобелковая последовательность на 30% идентична (с 67% гомологичностью)дрожжевой С8-С7 стерол-изомеразе, но при этом сам рецептор не обладаетданной ферментативной активностью [131].Селективные агонисты рецептора сигма-1 широко используются вклинической практике для лечения различных психических расстройств [132,133]. В настоящее время показано, что наличие рецептора сигма-1 необходимодля нормального нейрогенеза в гиппокампе и проецированию аксонов дляформирования правильных синаптических контактов [134-136]. В целом,стимуляция рецептора оказывает нейропротекторный эффект в условияхклеточного стресса и повреждений [137-140].
Более того, фармакологическаяактивациярецепторанейродегенеративныхпоказаласвоюзаболеваний,какэффективностьболезньнамоделяхАльцгеймератаких(PRE-084,ANAVEX1-41) [141-144], Хантингтона (PRE-084, 3-PPP, Pridopidine) [145, 146],Паркинсона [147], бокового амиотрофического склероза (PRE-084) [148], и рядадругих [149].Считается, что рецептор функционирует как белок-шаперон, регулируя,посредствомбелок-белковыхвзаимодействий,разнообразныевнутри-и- 31 -внеклеточные функции [128]. Так, присутствие рецептора на мембране (вотсуствие стимуляции лигандами) является достаточным для модуляцииактивности ряда ионных каналов: калиевых каналов hERG [150], Kv1.4 [151],Kv1.5 [151], кальциевого канала N-типа [152], инозитол-1,4,5-трифосфатногорецептора [128] и многих других [153].
Его функциональная активность илокализация в клетке зависят от функционального состояния клетки и изменяютсякак при стимуляции лигандами, так и в условиях стресса в ЭР . В неактивномсостоянии S1R способен формировать устойчивый комплекс с белком связыванияиммуноглобулиновBiP–резидентнымбелком-шаперономЭР(bindingimmunoglobulin protein). Стабильность данного комплекса может регулироватьсякак посредством концентрации кальция в люмене ЭР, так и при стимуляцииагонистами и антагонистами рецептора.Ранее было показано, что рецептор сигма-1 обнаруживается в составеконтактных областей между ЭР и митохондрии (MAM – mitochondria associatedmembranes), где он необходим для нормальной меж-органельной сигнализации:обмена АТФ и Ca2+ между двумя клеточными компартментами. Было показано,что связывание S1R с IP3Rприводит к стабилизации Ca2+-проводящей функциипоследнего, что играет ключевую роль в процессах обмена между ЭР имитохондриями.1.3.2 Структурная организация рецептора сигма-1По последним данным рентгеноструктурного анализа, S1R представляетсобой гомоолигомер, состоящий из трех белковых субъединиц [154].
Каждыймономер имеет один трансмембранный участок (а.к.о. 9-31), и С-концевой бетаскладчатый домен, подобный белкам-купинам (рис. 3) [154]. На N-конце белкарасположен ди-аргининовый (R7-R8) мотив, который, как считается, являетсясигналом удержания рецептора в мембранах ЭР [155, 156]. Поверхность,обращенная к мембране, является гидрофобной и погружена в липидный бислой.Так, в кристаллической структуре в данной области рецептора были определеныкоординированныелипидныемолекулы.Согласноданнымэлектронной- 32 -микроскопии, С-концевая область рецептора обращена в люмен ЭР, а короткаяпоследовательность, предшествующая трансмембранному участку – в сторонуцитоплазмы [157].Рис.
3 Кристаллическая структура рецептора сигма-1. N-концевая область, обращенная вцитозоль, показана синим, трансмембранный участок показан красным, С-концевой фрагмент –зеленым цветом. В кристаллической структуре белок представляет собой тример. Плоскаягидрофобная поверхность, представленная двумя спиралями, погружена в липидный бислой.Структура, полученная методом РСА, согласуется с рядом другихисследований (биохимических и спектральных), указывающих на то, что рецепторсигма-1 является функционально активным только в олигомерном состоянии[158-161].
В свою очередь, было показано, что связывание лигандов приводит кстабилизации олигомерной структуры рекомбинатного MBP-S1R [159].1.3.3 Механизм функционирования рецептора сигма-1Интересным, но нерешенным на настоящий момент вопросом являетсямеханизмфункционированиярецепторасигма-1вклетке.Согласнообщепринятой точке зрения, рецептор сигма-1 является дополнительнойструктурной субъединицей большого числа ионных каналов либо способенмодулировать активность ряда рецепторов опосредованно через белок-белковыевзаимодействия [162].
Тем не менее, данное предположение не лишено слабых- 33 -сторон. Во-первых, согласно недавно определенной кристаллической структуререцептор сигма-1 представляет собой однотрансмебранный белок, что указываетна то, что он может формировать лишь ограниченное число взаимодействий сбелками-партнерами посредством единственной трансмембранной спирали.
Вовторых, многие из рецепторов ЭР (например, IP3-рецепторы) обращены своимирегуляторные доменами в сторону цитоплазмы, в то время как большая частьрецептора сигма-1 обращена в люминальную сторону ЭР. Таким образом, S1Rможет формировать лишь ограниченное число взаимодействий, опосредованныхне-трансмембранными доменами. Наконец, во многих исследованиях былопоказано разнонаправленное влияние рецептора на эффекторные белки, дажепринадлежащие к одному классу (например, на потенциал-зависимые калиевыеканалы [151, 163]). Таким образом, несмотря на многолетние функциональные иструктурные исследования S1R, до сих пор не выяснена его однозначнаяфизиологическая роль.1.3.4 Биофизические подходы для изучения мембранных белковВ геноме человека порядка 20-30% генов кодируют мембранные белки.Мембранные белки ответственны за превращение энергии, являются рецепторамивне- и внутриклеточных сигнальных молекул, являются ферментами, образуютканалы активного и пассивного транспорта.
Некоторые мембранные белки могутбыть интегральными, то есть пронизывать мембрану, другие могут бытьассоциированыстрансмембраннымибелкамизасчетневалентныхвзаимодействий или прикрепляться к мембране с помощью ковалентно связанныхмолекул жирных кислот (периферические). Более 50% процентов имеющихся нарынкефармацевтических препаратов являются модуляторамиактивностимембранных белков, рецепторов и каналов. Несмотря на важность детальнойструктурной информации о мембранных белках с точки зрения фундаментальнойи прикладной наук, на настоящий момент известны структуры лишь 700мембранных белков.- 34 -В своем нативном состоянии трансмембранные участки интегральныхмембранных белков погружены в липидный бислой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
