Диссертация (1144259), страница 5
Текст из файла (страница 5)
В тех случаях, когда уже известна структура белкагомолога или структура белка в другой кристаллической упаковке, можноиспользовать имеющуюся структурную информацию для расчета начальных фаз.Помимо этого, структуры белков дикого типа могут использоваться для расчетафаз мутантных форм или комплекса белка с лигандом. С помощью методамолекулярного замещения определяется положение белковой молекулы вэлементарной ячейке кристалла, после чего фазовая информация от моделисовместно с экспериментальной информацией об амплитудах структурныхфакторов используется для расчета распределения электронной плотности. Внастоящее время, метод молекулярного замещения применяется более, чем в 70%случаев определения структур белков.Для того, чтобы успешно использовать метод молекулярного замещения,используемая для поиска структура должна обладать достаточной степеньюгомологиисоструктуройисследуемогобелка(обычно,выше30%).Гомологичность первичных аминокислотных последовательностей должна быть,как правило, выше (>50%).
По полученным данным возможна реконструкцияпериодического распределения электронов в кристалле, или получение такназываемой карты распределения электронной плотности. Так как кристаллпериодичен, то для определения всей его структуры необходимо знатьструктурную организацию только его элементарной ячейки — минимальнойобласти пространства, трансляцией которой можно восстановить кристалл.Разрешениепоказывает,насколькодетальнойпредставляетсянамкартаэлектронной плотности. После расчета карты электронной плотности становитсявозможным построение модели белка. Модель является интерпретацией карты- 23 -электронной плотности.
В случае белков разрешение очень редко оказываетсядостаточным для того, чтобы по интенсивности пиков на карте электроннойплотности можно было определить положение и атомный номер атома. Мыполагаемся на знание химической структуры белка.После построения модели необходимо осуществить несколько циклическихэтапов ее уточнения. Уточнение основано на сравнении интенсивностейдифракционных максимумов, которые бы давала наша модель, с интенсивностьюмаксимумов, измеренных в эксперименте.
Очевидно, что в случае идеальноймодели расхождение равнялось бы нулю. В реальности это не так, и приварьировании углов, длин связей в модели добиваются максимальной сходимостиэтих двух величин.Последнимэтапомслужитэтапвалидации,илиподтверждениядостоверности структуры. Под этим понимается оценка того, является липолученная модель физически возможной.1.2 Структурно-функциональная характеристика хантингтина1.2.1 Общая характеристика болезни ХантингтонаБолезнь Хантингтона (БХ), иначе называемая хореей Гентингтона, являетсятяжелымаутосомно-доминантнымнаследственнымнейродегенеративнымзаболеванием головного мозга.
В 1993 году была установлена мутация,приводящая к развитию заболевания, которая свзана с экспансией триплета CAGв кодирующей части гена хантингтина HTT [58].БолезньХантингтонаявляетсяаутосомно-доминантнонаследуемымзаболеванием, таким образом, для фенотипического проявления у индивидуумадостаточным является наличие одного мутантного аллеля, унаследованного отродителя. Частота встречаемости заболевания варьирует в разных популяциях,составляя порядка 5-10 случаев на 100000 для европейская и североамериканскойпопуляций [59].
Ювенильной формой болезни Хантингтона называют формузаболевания, развивающиеся в раннем возрасте (ориентировочно, около 20 лет).Экспансия триплета CAG «цитозин-аденин-гуанин» в кодирующей части белка (в- 24 -регионе первого экзона гена) на белковом уровне приводит к образованиюмутантного белка хантингтина. Наличие мутантного белка в клетке приводит кнарушению внутриклеточного метаболизма и, в конечном счете, к клеточнойгибели. Известно, что наиболее подверженным хантингтина-опосредованнойнейродегенерации является средние шипиковые нейроны стриатума, илиполосатого тела, которое относится к базальным ганглиям головного мозга [60,61].Симптомыпрогрессированиязаболеваниязаболевания.развиваютсяБХиусугубляютсяхарактеризуетсятремяпомереосновнымиклиническими симптомами: психические расстройства, часто ассоциируемые свысоким уровнем самоубийств, снижение когнитивных способностей, иэкстрапирамидные расстройства.
Все три указанные патологии стремительнопрогрессируют и в конечном итоге приводят к слабоумию и кахексии.1.2.2 Структура и функция хантингтинаБелок хантингтин (huntingtin, Htt) является разнообразным по своейструктуре и в гене хантингтина обнаружено множество полиморфизмов, которыеприводят к различному числу повторов CAG у индивида. В белке дикого типа(нормальном) содержится от 6 до 35 повторов, в свою очередь, у индивидов склиническими проявлениями БХ число повторов от 36 до 155.
Возрастматифестации заболевания обратно коррелирует с количеством полиГ повторов уносителя [62]. Расчетная масса белка хантингтина примерно 350 кДа, хотя этавеличина является вариабельной в зависимости от числа повторов в гене. Кнастоящему моменту функция хантингтина в клетке остается неизвестной. Внедавнем протеомном исследовании было идентифицировано порядка 700белков-кандидатов, предположительно взаимодействующих с хантингтином вклетке [63].
Накопленные знания свидетельствуют о том, что хантингтин в нормеявляется цитоплазматическим белком и ассоциирован с мембранами ЭПР,аппарата Гольджи, митохондрий [64-67]; обеспечивает поддержание нормальнойморфологии ЭПР, аппарата Гольджи [68, 69]; принимает участие в аксональном- 25 -транспорте [70, 71]. Показаны связь хантингтина с белком Rab5 ранних эндосом,и его влияние на их динамику [72]; непосредственное связывание хантингтина срецепторами инозитол-1,4,5-трифосфата, влияющее на процессы регуляциикальциевого гомеостаза [73-75]; его вовлеченность в процессы энергетическогообмена [76, 77] и транскрипции [78-80].Основная, существующая на сегодняшний день, гипотеза состоит в том, чтомутантный хантингтин (mHtt) с удлиненным (>36 а.к.о.) полиглутаминовымтрактом приобретает новую, токсичную функцию [81]. Было предположено, чтомутантный хантингтин формирует токсичные цитоплазматические и ядерныеагрегаты, которые нарушают такие процессы в нейронах, как транскрипция генов,протеосомная деградация, аксональный транспорт, эндоцитоз, синаптическаяпередача и кальциевая сигнализация [6, 82-88].
Ранее было показано, чтоэкспрессия полиГ-удлиненного первого экзона хантингтина достаточна дляфенотипического проявления заболевания в мышиной модели [89, 90]. Крометого, существует ряд доказательств в пользу протеолитического расщепленияхантингтинакаспазами-2,-3,-6,кальпаинами,и,возможно,другимиэндопептидазами, в качестве первого этапа инициации патогенетического каскада[91-93].Структура полноразмерного хантингтина была недавно определена методомкриоэлектронной микроскопии (PDB 6EZ8) [94]. Структура хантингтина состоитиз трех доменов: множественных N- и C-HEAT-повторов и расположенных междуними более маленьким соеденительным доменом («мостиком») (рис.
2). На Nконце21повтор(91-1684а.к.о.)формируютплотноупакованнуюсоленоидоподобную структуру. Участок, соответствующий первому экзонухантингтина, не был разрешен в криоэлектронной структуре полноразмерногобелка, и был определен ранее методом РСА (рис. 2, вкладка). 12 С-концевыхHEAT-повторов (2092-3098 а.к.о.) формируют вытянутое эллиптическое кольцо.Две части белка соединены между собой соеденительным доменом-«мостиком»(1685-2091 а.к.о.), образованным тандемными альфа-спиральными армадиллоповторами.- 26 -Рис. 2. Пространственная структура полноразмерного белка хантингтина(PDB 6EZ8), Вкладка: структура и первичная аминокислотная последовательность первогоэкзона (exon 1) хантингтина.
Участок N17 показан зеленым, полиглутаминовый тракт –оранжевым, полипролиновый тракт – синим цветом (PDB 3IOR).Структура первого экзона хантингтина с 17 и 36 остатками глутамина былаопределена с помощью РСА (рис. 2, вкладка) (PDB 3IOR, 3IOT, 3IO4, 3IOW) [55].В разных кристаллах и для разных молекул симметрически-независимой частиячейки наблюдалась структурная гетерогенность в области полиглутаминовоготракта. Участок, предшествующий полиГ (N17) во всех кристаллах был разрешенкак амфипатическая альфа-спираль.
ПолиГ тракт в N-концевой области такжеявляется альфа-спиральным, но переходит в конформацию свободной петлиближе к С-концу, что указывает на низкий энергетический барьер, разделяющийэти две вторичные структуры. С-концевая область полиГ более структурирована иформирует полипролиновую спираль, как и следующий за ним полипролиновыйтракт.Такимобразом,конформацияполиглутаминаотчастидиктуетсяфланкирующими его последовательностями. В структуре хантингтина с 36- 27 -остатками глутамина была также обнаружена бета-шпилечная структура вобласти полиГ.1.2.3 Подходы к разработке лигандов, предотвращающихвнутриклеточную агрегацию хантингтинаПоскольку полиГ-удлиненные белки склонны к токсичной макроагрегации,одна из возможных стратегий может заключаться в том, чтобы использовать саммутантный хантингтин в качестве терапевтической мишени. Применениеантисмысловыхнуклеотидныхпоследовательностейпротивмутантногохантингтина показало улучшения в поведенческих и нейропатологическихнарушениях в мышиной модели болезни Хантингтона [95].
Было показаноснижение мРНК кодирующей мутантный хантингтин с помощью антисмысловыхдля CAG повтора олигомеров пептидо-нуклеиновых кислот и замкнутыхнуклеиновых кислот [96]. Другой потенциальной стратегией может бытьблокирование способности мутантного хантингтина формировать токсичныеагрегаты. Несколько малых молекул были идентифицированы в скринингах вкачестве ингибиторов агрегации полиглутамин-удлиненных белков , тем неменее, ни одна из молекул-кандидатов не прошла клинические испытания, восновном из-за своей низкой эффективности [97-100]. Более высокоспецифичныесоединения, в частности, выработанные против полиГ анти- и интратела,эффективно подавляли агрегацию в моделях БХ [101-103].
Однако, посколькугеном человека содержит несколько сотен белков, содержащих поли- и олигоГпоследовательности (в особенности, такими последовательностями обогащенытранскрипционные факторы), создание лигандов против полиГ может столкнутьсяс проблемой офф-таргетного эффекта.В последние годы внимание было обращено на последовательности,фланкирующие полиГ тракт хантингтина: N-концевой участок хантингтина,предшествующий полиглутаминовому тракту (N17) и полипролиновый (полиП)тракт, следующий непосредственно за ним.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
