Диссертация (1144259), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Полиглутаминовый тракт является вариабельным подлине: 10-40 а.к.о (медианная длина – 14 а.к.о.) у нормальных индивидуумов исвыше 55 а.к.о (55-84 а.к.о.) у больных СМА 3. ПолиГ тракт атаксина-3представляет собой почти целиком гомополимерную последовательность,прерванную одним остатком лизина: QQK(Q)n [13].Рис.
1. Доменная структура атаксина-3 и последовательность MBP-Atxn3-C, использованнаядля кристаллизации. А.к. последовательность MBP показана серым, N-концевая фланкирующаяпоследовательность – зеленым, полиГ тракт – оранжевым, С-концевая фланкирующаяпоследовательность – синим, С-концевая последовательность, добавленная для кристаллизации– желтым цветами.- 18 -Считается, что физиологическая роль атаксина-3 заключается в контролеубиквитин-опосредованной протеасомной деградации белков [1].
За счетдеубиквитинирующей активности атаксин-3 способен ремоделировать длинные(длинойболеечетырехполиубиквитиновыецепиубиквтинов,[14].преимущественноЭкспрессияK63-связанные)мутантногокаталитически-неактивного атаксина-3 приводила к накоплению убиквитинированных белков вклетке, в то время как сверхэкспрессия в модели полиглутаминовой токсичностипоказала нейропротекторный эффект [15, 16].
Одной из внутриклеточныхмишеней является сам белок атаксин-3. Участки UIM1/UIM2 участвуют всвязывании убиквитина для нормального позиционирования субстрата поотношению к каталитическому сайту атаксина-3 для его последующегоотщепления.Впротеомныхисследованияхпартнероватаксина-3былоопределено большое количество разнообразных белков, что указывает навовлеченность атаксина 3 в большое количество физиологических процессов [1719].
Было показано, что атаксин-3 непосредственно взаимодействует (черезпоследовательность 277-291 а.к.о., фланкирующую полиГ) с челночным белкомVCP/p97,регулируядоставкуполиубиквитинилированныхбелковнапротеасомную деградацию [20]. Среди других внутриклеточных партнеровследует упоминуть E3-убиквитин лигазы, многие из которых сами подвергаютсяубиквитинилированию [1, 15, 21]. Атаксин-3, формируя мультисубъединичныекомплексы с E3-субстратными комплексами, регулирует как их активность, так иредактирует убиквитиновые цепи белков-субстратов [1, 15, 21, 22].1.1.3 Участие атаксина-3 в развитии СМА 3В настоящее время не существует единого мнения о том, каким образомудлиненныеполиглутаминовыепоследовательностиобуславливаютвозниктовение того или иного патологического процесса. Известно, чтомутантныеполиГ-удлиненныебелкиобразуютамилоидоподобныевнутриклеточные и ядерные агрегаты [23-27]. Более того, рекомбинантные полиГудлиненныебелкииизолированныепоследовательностиспособны формировать фибриллы в экспериментах in vitro.полиглутамина- 19 -Помимо гомоолигомеризации, простые аминокислотные повторы могутопосредовать белок-белковые взаимодействия.
Так, было показано, что полиГстабилизирует формирование суперспиральных структур [28, 29]. Таким образом,полиглутаминовыепоследовательностиопосредуюткакнормальныемежмолекулярные белок-белковые взаимодействия, так и патологическуюгомоолигомеризацию белков.Как и в случае других полиглутаминовых заболеваний, мутантный атаксин3 формирует внутриклеточные (преимущественно, ядерные) включения [30].Кроме того, мутации оказывают влияние на стабильность белка.
Так, былопоказано, что немутантный атаксин-3 также формирует амилоидоподобныеструктуры [31]. На этом этапе агрегации вовлечен Джозефин-домен, агрегация засчет которого приводит к образованию небольших протофибрилл, в то время каквторойэтапагрегацииявляетсяполиГ-опосредованнымиприводиткнеобратимому образованию SDS-нерастворимых агрегатов [32, 33]. Второй этапагрегации наблюается только для полиГ-удлиненных белков и заключается вконформационном переходе α→β в области полиглутаминового тракта [33].Подобные двухстадийные агрегационные механизмы ранее были предложены дляхантингтина, атаксина-1 и андрогенового рецептора [34-38]. Нормальный имутантный атаксин-3 может подвергаться протеолитическому расщеплению, что,в случае мутантной формы, ускоряет его агрегацию [39]. Кроме того, мутантныйатаксин-3 формирует абберантные белок-белковые взаимодействия (в частности,с инозитол-1,4,5-трифосфатными рецептором, а также ионными каналамиплазматической мембраны клетки) или сильнее связывается со своими белкамипартнерами (VCP/p97, CHIP, parkin) и ДНК [15, 19-21, 40-44].Таким образом, токсичность мутантного атаксина обусловлена различнымимеханизмами:образованиеммономерныхформ,характеризующихсяаббератнтными взаимодействиями с внутриклеточными партнерами атаксина-3;формированиемнерастворимыхцитотоксичныхядерныхвключенийисоответствующей утратой нормальной функции белка; нарушениями в системе- 20 -белковойдеградациивследствиенакоплениябелковыхвключений;транскрипционными нарушениями.1.1.4 Структура и функция полиглутаминовых последовательностейПоскольку токсичность полиГ-содержащих белков связана приобретениемими новой функции вследствие конформационных изменений, происходящих приудлинении полиглутаминового тракта, то возникает необходимость в детальномизученииструктурыподобныхбелков.Однакорентгеноструктурныеисследования осложнены склонностью полиГ-содержащих белков к агрегации.Поэтому структурные исследования, прежде всего, включали в себя изучениеизолированнойполиглутаминовойпоследовательностиэтогобелкаифланкирующих ее последовательностей такими физическими методами, каккруговой дихроизм [45, 46], ЯМР [12, 47, 48], а также вычислительнымиметодами, например, методами молекулярной динамики [49-52].
Структураполиглутаминового тракта в линейной конформации была определена вкомплексе с антителом, выработанным против полиглутаминового участка [53].Единственными кристаллическими структурами полиГ области в нативномбелковом контексте являются установленные в нашей лаборатории структурыпервого экзона хантингтина с 17 и 36 остатками глутамина [54, 55].Дифракционные качества кристаллов были ограничены и дифракционные данныебыли собраны до 3.6 Å и 3.0 Å, соответственно, а установление и уточнениеструктурыбылодополнительноосложненоналичиеммножественныхконформаций полиГ в кристалле.
Как было показано в данных работах, полиГтракт хантингтина может существовать в двух конформациях: случайной петли иальфа-спирали. С учетом вышесказанного, интересной, хотя и объективнотрудоемкой задачей, остается установление кристаллической структуры полиГ сболее высоким разрешением.1.1.5 Методы установления структуры белков. Рентгеноструктурныйанализ.Рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ (РСА) занимаетлидирующее место в качестве метода для установления атомной структуры- 21 -биомакромолекул. На настоящий момент определены более 130000 структурбиополимеров — и это число продолжает расти [56].
Являясь неотъемлемойчастью научных исследований в современной биологии, рентгеноструктурныйанализ способен предоставить детальную информацию не только о структуребелковой молекулы, но и о механизмах работы, точную информацию омежмолекулярныхвзаимодействияхфермент-субстратныхкомплексов,структурных перестройках при активации рецепторов. Структурная биология какобластьзнанийобязанасвоимпоявлениемстановлениюметодарентгеноструктурного анализа. Метод широко применяется как для решенияфундаментальных проблем, будь то понимание молекулярных основ заболеваний,механизмов функционирования ферментов или создания новых белковых молекулde novo; так и в прикладных исследованиях по разработке лекарственныхсоединений и антибиотиков [57].Первым этапом РСА является получение кристаллов интересующеговещества, или этап кристаллизации.
В случае лабильных биомакромолекул этапполучения качественных белковых кристаллов является одним из самых сложныхивремязатратных.Вбольшинствеслучаевприналичиидостаточныхматериальных и человеческих ресурсов можно получить кристалл белка. Однако,в некоторых случаях этого не получается сделать и тогда переходят ккристаллизациибелков-гомологовимутантныхформ.Дляполучениядифракционной картины кристалла он монтируется на гониометрической головкедифрактометра,чтопозволяетточнорегулироватьповоротыкристалла.Источником рентгеновского излучения почти во всех случаях является либохарактеристическое излучение меди, либо синхротронное излучение.После получения дифракционной картины и начальной обработки данных,получают массив интенсивностей дифракционных максимумов, в которомсодержится информация о кристаллической структуре и взаиморасположенииатомов в кристалле. Однако, как уже упоминалось, после рентгеновскогоэксперимента остается неопределенность по фазе.
В классическом экспериментерегистрируетсяинтенсивностьрентгеновскогоизлучения,которая- 22 -пропорциональна квадрату амплитуды рассеянной волны, однако, информация офазе рассеянной волны теряется. Несмотря на попытки экспериментальногоопределенияфазовойинформациинепосредственноврентгеновскомэксперименте, фазовая составляющая должна быть получена либо проведениемдополнительных измерений (экспериментальное определение фаз), либо путемпривлечения дополнительной информации о структуре макромолекулы (методмолекулярного замещения).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
