Диссертация (1144259), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для этогоклетки за сутки пассажировали таким образом, чтобы плотность клеток на моменттрансфекции составляла 60-70%. Смесь для трансфекции (в расчете на одну лунку6-луночного планшета) содержала 100 мкл бессыворточной среды DMEM, 1,5 мкгочищеннойпДНК,инкубировалив4,5 мкгтечениеПЭЭ.20 минутСмесьприинтенсивнокомнатнойперемешивалитемпературе.иЗатемтрансфекционную смесь добавляли к клеткам в бессывороточной среде DMEM(500 мкл).
Через четыре часа после трансфекции смесь удаляли и добавлялиобычную культуральную среду, дополненную 10% FBS. Клетки линии Sf9трансфецировали с помощью реагента CellFectin2 (Invitrogen, США) согласнорекомендациям производителя. Первичные культуры нейронов трансфецировалис помощью кальций-фосфатной трансфекции с помощью набора реагентовCalcium transfection kit (Clontech) согласно рекоменациям производителя. Дляэтого среду, в которой культивировались нейроны, отбирали и заменяли набессывороточнуюсредуспреципитатамифосфатакальцияиДНК,сформированных в HEPES-буфере и инкубировали в течение часа.
Послетрансфекции среду закисляли 10% СО2 для растворения преципитатов. Послеэтого среду заменяли на кондиционированную среду и культивировали дляпоследующего анализа.- 57 -В ряде экспериментов первичные культуры нейронов трансдуцировали спомощью лентивирусных частиц, содержащих вставки интереса.
Для получениярекомбинантных лентивирусных частиц клетки лини HEK293T трансфецировалис помощью челночных векторов LV-S1R-6His, LV-S1R-R7ER8E-6His и двухвспомогательных плазмид pCMV-Δ8.9 и pVSVg как описано выше. Спустя 48-72часа после трансфекции культуральную среду собирали, центрифугировали при2000 g в течение пяти минут, фильтровали с помощью 0,45 мкм фильтра,замораживали и хранили при -80 °С.
Титр вируса при заражении нейрональныхкультуропределялиэмпирическисцельюдостижениямаксимальнойтрансдукции при минимальной токсичности.2.5.5 Иммунофлуоресцентная микроскопияДляизучениявнутриклеточнойлокализацииS1Rклетки,трансфецированные плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки интереса,культивировали на предметных стеклах, послу чего фиксировали в 4% растворепараформальдегида в PBS. Стекла монтировали в жидкости для заключения AquaPoly/Mount (Polysciences, Германия) для последующего исследования с помощьюлазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica,Германия).Для окрашивания кортико-стриатальных культур на маркер среднихшипиповых нейронов DARPP32 использовался метод иммуноцитохимии. Дляэтого клетки окрашивали первичными антителами против DARPP32 (1:500, CellSignallin, США) и вторичными антителами, коньюгированными с флуорофоромAlexa488 (1:1000, Invitrogen, США).Для определения, находятся ли две флуоресцентно-меченые молекулы водном компартменте (домене), использовали метод расчета коэффициентаколокализации.
Для этого пользовались формулой расчета коэффициентаколокализации Мандерса для расчета колокализации канала 488 нм (проба GFP) сканалом 561 нм (проба mCherry-ER):- 58 -Mc ( Ri Gi )i22 Ri GiiгдеRi , Gi,i- интенсивности i-го пикселя изображения для первого и второгоканалов, соответственно.2.5.6 Биохимическое фракционирование органеллДля выделения митохондрий, ЭР, митохондрий-ассоциированных мембрани цитоплазматической фракции пользовались методикой, описанной ранее M.Wieckowski с соавторами [206]. Для этого клетки, культивируемые на шести60 см2 чашках, собирали и лизировали в буфере (225 мМ маннитол, 75 мМсахароза и 30 мM Tris–HCl pH=7,4).
После гомогенизации через иглу G30 ядра инелизированные клетки осаждали центрифугированием (1000 g, 15 минут).Митохондрии также осаждали центрифугированием послеядерного супернатанта(7000 g, в течение 20 минут) и трижды промывали в буфере для промывки(225 мМ маннитол, 75 мМ сахароза и 30 мM Tris–HCl pH=7,4), а затемресуспендировали (250 мM маннитол, 5 мM HEPES pH=7,4 and 0,5 мM ЭГТА).Супернатант, представляющий собой цитозоль и микросомальную фракцию,разделяли центрифугированием (200000 g, 1 час). Митохондрий-ассоциированныемембраны отделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотностиперколла (225 мM маннитол, 25 мM HEPES pH=7,4), 1 мM ЭГТА и 30% об/обPercoll, Sigma-Aldrich, Германия) (ротор SW55, Beckman-Coulter при 100000 g втечение одного часа).
Тяжелая фракция представляла собой митохондрии, в товремя как легкая фракция представляла собой митохондрий-ассоциированныемембраны. Обе фракции были различимы после центрифугирования в градиентеперколла как белые диски. Обе фракции отбирали с помощью пастеровскойпипетки (сначала тяжелую фракцию, затем легкую фракцию) и ресуспендировалив буфере для ресуспендирования митохондрий. Тяжелую фракцию переосаждалицентрифугированием при 7000 g в течение 20 минут, осадок представлял собойочищенную митохондриальную фракцию.
Легкую фракцию переосаждали- 59 -центрифугированием при 200000 g в течение 1 часа (ротор Ti100, BeckmanCoulter),осадокпредставлялсобойочищеннуюфракциюмитохондрий-ассоциированных мембран. Для последующего Вестерн-блот анализа общуюконцентрацию белка в каждой фракции определяли колориметрически по методус бицинхониновой кислотой (BCA protein assay kit, Pierce, США) с цельюнанесения одинакового количества белка на каждую дорожку ПААГ геля.2.6 Изучение белок-липидных взаимодействий2.6.1 Pull-Down с холестерин-агарозойСинтезхолестерин-агарозы.Дляизученияпрямыхвзаимодействийрецептора сигма-1 с холестерином был проведен pull-down эксперимент посвязыванию с холестерин-агарозой.
Для этого, DADPA (диаминодипропиламинсефароза)(GBiosciences,США)былаконьюгированасхолестерилгемисукцинатом. Для этого, к смоле, предварительно промытой в безводномдиметилформамиде (ДМФ), добавляли холестерил гемисукцинат (Avanti PolarLipids, США) (2 гр/эквивалент), растворенный в ДМФ, HBTU (2 гр/эквивалент) иDIPEA (4 гр/эквивалент).
Общий объем смеси составлял 5 мл/мл смолы. Реакциюконденсации проводили в течение 4 часов при 37 °С и интенсивномперемешивании. После этого смолу трижды промывали десятикратным объемомДМФ, трижды метанолом, трижды бидистилированной водой и трижды буферомдля связывания.Pull-down.
Для изучения связывания с холестерин-агарозой к 50 мкл смолыдобавляли 5 мкг выделенного рекомбинантного рецептора. В случае эндогенногобелка, к 50 мкг смолы добавляли 200 мкг общего клеточного лизата (50 мМHEPES pH=8,0, 200 мМ NaCl, 1% LDAO, 1% Triton X-100). Общий объемдоводили буфером для связывания (50 мМ HEPES pH=8,0, 200 мМ NaCl, 1%LDAO, 1% Triton X-100) до 1 мл. После 3-4 часов инкубации при 4 °С иинтенсивном перемешивании смолу трижды промывали 15 мл буфера длясвязывания, добавляли 30 мкл буфера без детергентов и готовили пробыкипячениемвдвухкратномстандартномЛэммли-буфередляПААГ- 60 -электрофореза.Вконтрольныхэкспериментахиспользоваласьсефароза,полученная без добавления холестерил гемисукцината на этапе синтеза.2.6.2 Липосомный Pull-DownДля оценки связывания S1R с различными типами липидов использовалсяметод липосомного pull-down.
Для этого рекомбинантный рецептор встраивался влипосомы, полученные из различных липидных смесей. Подробная процедурареконструкции приведена ниже. Смеси для получения протеолипосом содержалилипидхДОФХ(1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин18:1)иразличныеконцентрации сфингомиелинов. Эффективность реконструкции оценивали спомощью Вестерн-блот анализа полученных протеолипосом.2.7 Исследования рецептора сигма-1 в «гигантских»одномембранных липосомах2.7.1 ЛипидыВ работе использовались следующие липиды: 1,2-диолеил-sn-глицеро-3фосфохолин 18:1 (ДОФХ или DOPC), сфингомиелины головного мозга (СМ),1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин 16:0 (ДПФХ или DPPC), холестерин,16:0-06:0 NBD PC (NBD-ФХ или NBD-PC) (Avanti Polar Lipids, США). Липиды,растворенные в хлороформе, были аликвотированы в стеклянные ампулы ихранились в атмосфере аргона при -20 °С.2.7.2 Получение протеолипосомДля реконструкции и встраивания рецептора в липидный бислой на первомэтапе получали большие одномембранные липосомы приблизительного диаметра100 нм.
Для этого, липидные смеси соответствующего состава высушивались подструей аргона до образования тонкой липидной пленки. Остаток растворителяудаляли под вакуумом в течение не менее трех часов. После этого липидныепленки регидрировали в течение часа в буфере следующего состава: 50 мМHEPES pH=8,0, 200 мМ NaCl и экструдировали через поликарбонатныймембранный фильтр с диаметром пор 100 нм не менее 10 раз (Avanti Polar Lipids,- 61 -США). Полученные липосомы смешивали с очищенным рекомбинантнымрецептором сигма-1 (соотношение липиды:белок=1:50 в/в) и титровали 10%раствором Triton X-100 или 10% раствором DDM (додецил-β-D-мальтозид,Anatrace,США)додостиженияоптическойплотностиOD(550 нм)=0,5xотносительно первоначального поглощения раствора несолюбилизированныхлипосом [207, 208]. Добавление детергента было необходимо для частичнойсолюбилизации липидов и последующего встраивания белка в бислой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
