Автореферат (1141403), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Определение аминокислот проводили на высокоскоростномаминокислотном анализаторе фирмы «Hitachi» (Модель 835, Япония). Колонка 40×150 мм,наполненная катионообменной смолой марки Hitachi Custom ion-Exchange Resin № 2619. ПФ– Na-цитратные буферные растворы (I – 0,18 н (рН = 3,25); II – 0,3 н (рН = 3,9); III – 1,6 н (рН= 4,75)). Программа подачи буферных цитратных растворов – стандартная (скорость потока32 мл/час). Скорость подачи нингидринового реактива – 20 мл/час.
Колориметрическоедетектирование окрашенных комплексов – при 2-х длинах волн (λ = 570, 440 нм)одновременно в непрерывном режиме.Определение углеводов. Анализ сахаров проводился методом прямо-фазовой ВЭЖХ срефрактометрическим детектированием. Содержание сахаров определяли в пересчете насоответствующий СО (глюкоза, галактоза, фруктоза, сахароза, арабиноза, манноза, ксилоза).Хроматограф Agilent 1260, ПО – ChemStation (ver. A.09.03). Колонка – Phenomenex Luna®NH2 (4,6×250 мм, 5 мкм).
Для свободных сахаров режим элюирования – изократический (ПФ– ацетонитрил/вода 70:30), для связанных сахаров – градиентное элюирование (ПФ «A» –вода; ПФ «B» – ацетонитрил; ПФ «C» – 100 мМ р-р K2HPO4 в воде). Скорость потока –1 мл/мин, tколонки = 25 °C. Объем вводимой пробы – 10 мкл. Для количественного определенияполисахаридовиспользовалась«Подорожника большого листья».методика,приведеннаявГФXIII,ФС.2.5.0032.1510Определение элементного состава. Проводили методом рентгенофлуоресцентногоанализа (РФА) с использованием рентгеновского спектрометра S4 Pioneer (Bruker,Германия).
Режим работы рентгеновской трубки керамической с родиевым анодом:напряжение U = 30 и 50 кВ, различная сила тока (I). При определении элементов в ряде Na-КI = 60 мА, а напряжение на трубке – 30 кВ; для ряда Ca-Pb – I = 40 мА, U = 50 кВ. Взависимости от содержания изменялось время набора импульсов – от 10 до 100 сек.Пробоподготовку и определение тяжелых металлов (Pb, Cd, Hg) и мышьяка проводили всоответствии с ОФС.1.5.3.0009.15 «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка вЛРС и ЛРП». Измерения проводили на спектрофотометре атомно-абсорбционном Z 5300(Hitachi, Япония). Для анализа катионов НГМ применялся метод зонального капиллярногоэлектрофореза на системе КЭ Agilent 3D-CE (США), снабженной диодно-матричнымдетектором (режим scan в диапазоне 190-600 нм). Кварцевый капилляр – Agilent G160061232 (увеличенный оптический путь, Lэффективная/Lобщая = 56 см/64,5 см, внутренний диаметр(ID) 50 мкм. Обработка данных проводилась с использованием ПО 3D-СЕ ChemStation Rev.В.04.03 (16).
Величина тока – 0-300 мкА, величина мощности – 0-6 Вт, диапазон напряженийсоставлял 0-30 кВ, электрокинетическое и гидродинамическое введение пробы, ID капилляров – 50, 75 и 100 мкм, tкапилляра = 25ºС. Ввод пробы: гидродинамический в течение 4 сек. придавлении 50 мбар. Напряжение – 25 кВ. Детектирование – УФ, λ= 210 нм (λсравнения = 350 нм).Определение биологической активности. Использовали следующие клеточныекультуры: Hela (аденокарцинома шейки матки человека) и Fet MSC (мезенхимальныестволовые клетки из костного мозга человеческого эмбриона).
Выращивание клеточныхкультур проводили в следующих условиях: t = +37 °C, атмосфера с 5% СО2, среда DMEMдля культур клеток, содержащая 10% эмбриональную телячью сыворотку крови (PAALaboratories). Для изучения цитотоксических эффектов АА проводили МТТ-тест. Дляисследований клетки вносили в культуральные 24-луночные планшеты (15000 клеток в 1лунку) и через 24 ч после посева в инкубационную среду вносили исследуемые растворы(ликорин 1 мг/мл, галантамин 1 мг/мл, НГМ и их разведения). Через 48 ч после добавлениярастворов в среду добавляли МТТ (0,25-0,5 мг/мл), затем клеточные культуры инкубировалив течение 4 ч при t = +37 °C в атмосфере с 5% СО2.
В конце инкубации окрашеннуюкультуральную среду отбирали и растворяли образовавшиеся кристаллы МТТ-формазана вподкисленном 50% изопропаноле (0,05н HCl). Концентрацию формазана, образованногоживыми клетками, оценивали методом СФМ (при λ = 570 нм). Интенсивность окраски,соответствующая концентрации формазана у необработанных клеток, принималась за 100%.В качестве СО использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества:галантамин (≥ 98%, 357-70-0, Nanjing Spring & Autumn Biological Engineering Co., Ltd11(NSABE), Jiang Su, China), ликорин (≥ 98%, 476-28-8, NSABE), кверцетин (≥ 99,5%, 117-39-5,ООО «Фитопанацея»), гиперозид (≥ 98,5%, 482-36-0, ООО «Фитопанацея»), кемпферол(≥ 96,0%, 482-36-0, Fluka), неохлорогеновая кислота (≥95,0%, 906-33-2, Sigma-Aldrich),хлорогеновая кислота (≥ 95,0%, 327-97-9, Sigma-Aldrich), криптохлорогеновая кислота(≥ 95,0%, 905-99-7, Sigma-Aldrich), щавелевая кислота (≥ 98,0%, 6153-56-6, Fluka), яблочнаякислота (≥ 99,0%, 6915-15-7, Sigma-Aldrich), янтарная кислота (≥ 99,5%, 110-15-6, Fluka),глюкоза (≥ 99,5%, 50-99-7, Fluka), галактоза (≥ 99,0%, 59-23-4, Sigma-Aldrich), фруктоза(≥ 99,0%, 57-48-7, Sigma-Aldrich), сахароза (≥ 99,5%, 57-50-1, Sigma-Aldrich), арабиноза(≥ 99,0%, 28697-53-2, Sigma-Aldrich), манноза (≥ 99,5%, 3458-28-4, Sigma-Aldrich), ксилоза(≥ 99,0%, 58-86-6, Sigma-Aldrich), стандартная смесь аминокислот (≥ 99,0%, Sigma-Aldrich).Изучение морфолого-анатомических признаков ГомЛРС подснежниковСвежее цельное сырьё подснежников представляет собой растения целиком,состоящие из надземной (листья, цветки и цветоносы) и подземной (луковицы и корни)частей.
Сравнение внешних признаков двух видов подснежников приводится в таблице 1.Сравнение микроскопических анатомо-диагностических признаков G. woronowii и G. nivalisпредставлено в таблице 2.Нами изучены внешние признаки ГомЛРС G. woronowii и G. nivalis, установленыразличия в характерных макродиагностических признаках, а также в линейных размерахорганов растений. Для двух видов подснежников отмечено характерное для рода строениецветка – 3 белых наружных листочка околоцветника обратнояйцевидной формы, 3 белыхвнутренних листочка околоцветника клиновидной формы, плоских, наверху с выемкой икрупным подковообразным зелёным пятном. Листья G.
woronowii без воскового налета, свыраженной складчатостью; листья G. nivalis с восковым налетом, ровные, без складок;наружные чешуи луковицы G. woronowii расположены ступенчато, а у G. nivalis на одномуровне. Проведено изучение анатомо-диагностических признаков ГомЛРС G. woronowii и G.nivalis: строение верхнего и нижнего эпидермиса листа (рис. 1, 2), эпидермиса лепестков свнутренней и внешней стороны, эпидермиса цветоноса, верхнего и нижнего эпидермисакроющих чешуй, верхнего и нижнего эпидермиса запасающих чешуй, корней, размерыклеток и клеточных включений (рафид оксалата кальция, крахмальных зерен), (рис.
3, 4).Для двух видов подснежников характерны следующие признаки: тетрацитный типустьичного комплекса, прямоугольные клетки эпидермиса листа, клетки эпидермисалисточка околоцветника с сосочковидными выростами, присутствие во всех органах заисключением цветка клеток с рафидами оксалата кальция. Установлено, что имеютсяразличия в линейных размерах как на макро-, так и на микроуровне.12Таблица 1Сравнение внешних признаков G. woronowii и G. nivalisПризнакСтроение и размерыФормаРасположениеВерхушка, основание ивлагалище листаХарактер края листаЖилкование листаОпушениеНаличие воскового налетаЦветСтроение околоцветникаСтроение венчикаПрицветникЦветоножкаЧисло и форма лепестковЧисло и строение тычинокЧисло пестиковОсобенности строениязавязиЦветФормаРазмерыХарактер поверхностиОпушениеЦветФормаРазмерНаружная поверхностьРасположение наружныхчешуйЦветG.
woronowiiЛистьяПростые, длина листа 15-23 см, шириналиста 1,5-2,5 смШироколанцетнаяВ почке один лист обхватывает другойЗаостренные, суживающиеся у основанияи постепенно переходящие во влагалища,длиной 3,5-6,0 смЦельныйПараллельноеОтсутствуетОтсутствуетЯрко-зелёный с желтоватым оттенком,поверхность блестящаяЦветкиПростой венчиковидныйАктиноморфныйЛинейный, пленчатый, длиной до 4 смДлиной 4,5 см3 наружных листочка околоцветникаобратнояйцевидные,слабовогнутыедлиной 2,3 см шириной 1,3 см; 3внутренних листочка околоцветникашириной 0,8 см, длиной 1,2 см, книзуклиновидносуженные,плоские,прямостоячие, наверху с выемкой6 на коротких нитях, прикрепленных коснованию околоцветника, длиной 0,6 см,пыльники с остроконечиями1Завязьнижняя,3-хгнёздная,продолговатая, длиной 0,3-0,4 см,столбик нитевидный с острым рыльцемНаружных листочков околоцветника –белый, внутренних листочков – белый скрупным подковообразным зелёнымпятном размером 1,6 ммЦветоносыЦилиндрическийДлиной 9-15 см, толщиной до 2,5 ммРебристыйГолыйЗелёныйЛуковицыГрушевиднаяДлина 3,0 см, диаметр 2,5 смСлегка морщинистая, покрытакожистыми чешуямиСтупенчатоеG.
nivalisПростые, длина листа 8-12 см, шириналиста 0,4-0,5 смЛинейнаяВ почке примыкают друг к другу плоскоТуповатые, немного суживающиеся уоснования и постепенно переходящие вовлагалища, длиной 2,0-4,0 смЦельныйПараллельноеОтсутствуетС восковым налётомТёмно-зелёный или сизый, поверхностьматоваяПростой венчиковидныйАктиноморфныйЛинейный, пленчатый, длиной до 2 смДлиной 2,5 см3 наружных листочка околоцветникапродолговато-обратнояйцевиднойформы, длиной 1,8 см, шириной 0,6 см; 3внутренних листочка околоцветникадлиной 1,0 см, шириной 0,4 см,клиновидной формы, плоские, наверху свыемкой6 на коротких нитях, прикрепленных коснованию околоцветника, длиной 0,5см, пыльники с остроконечиями1Завязь нижняя, 3-х гнёздная, округлая вдиаметре длиной 0,1-0,2 см, столбикнитевидный с острым рыльцемНаружных листочков околоцветника –белый, внутренних листочков – белый скрупным подковообразным зелёнымпятном размером 1 ммЦилиндрическийДлиной 7-10 см, толщиной до 1,5 ммСлаборебристыйГолыйЗелёныйГрушевидная или коническаяДлина 2,0 см, диаметр 1,5 смСлегка морщинистая, покрытакожистыми чешуямиНа одном уровнеФормаКроющих чешуй – жёлто-коричневый,без них – белыйКорниЦилиндрическая, шнуровиднаяКроющих чешуй – светло-коричневый,без них – белыйЦилиндрическая, нитевиднаяРазмерыЦветЗапах ГомЛРСВкус ГомЛРСДлиной до 25 см, в диаметре до 2 ммБелыйСлабый специфическийВкус не определяется (сырье ядовито)Длиной до 15 см, в диаметре до 1 ммБелыйСлабый специфическийВкус не определяется (сырье ядовито)13Таблица 2Сравнение микроскопических признаков G.
woronowii и G. nivalisПризнакКлетки эпидермисаУстьичный комплексЧастота встречаемости устьиц сверхней стороны листаЧастота встречаемости устьиц снижней стороны листаКлетки мезофилла листаРафиды оксалата кальцияЧастота встречаемости клеток срафидамиКлетки эпидермиса листочкаоколоцветникаПыльцевые зернаПрицветникиКлетки эпидермиса цветоносаУстьичный комплексЧастота встречаемости устьицРафиды оксалата кальцияЧастота встречаемости клеток срафидамиВнешний эпидермис наружнойчешуиВнутренний эпидермис наружнойчешуиВнешний эпидермис запасающейчешуиВнутренний эпидермис запасающейчешуиКлетки основной паренхимыРафиды оксалата кальцияЧастота встречаемости клеток срафидамиКрахмальные зёрнаСтроениеСтроение ЦОЦ, его диаметрКольцо деформированнойпаренхимыG. woronowiiЛистьяПрямоугольные, длиной 200-480мкм, 25-35 мкм ширинойТетрацитный тип (режепентацитный), округлые, диаметром45-55 мкмдо 10-15 на 1 мм2G.
nivalisПрямоугольные, длиной 185-395 мкм,23-31 мкм ширинойТетрацитный тип (реже пентацитный),округлые, диаметром 40-50 мкмдо 15 на 1 мм220-25 на 1 мм225-30 на 1 мм2Округлые, величиной 35-60 мкм70-120 мкм1-2,5 на 1 мм2Округлые, величиной 30-50 мкм45-50 мкм1,5-3 на 1 мм2ЦветкиМногоугольные округлыепрямостенные диаметром 60-80мкм, с сосочковидными выростамиОвальные, однобороздные,гетерополярные, гладкие, длиной21-26 мкм, шириной 16-19 мкмПо строению аналогичны листуЦветоносыПрямоугольные, длиной 190-470мкм, шириной 23-34 мкмТетрацитный тип, округлые,диаметром 45-55 мкм19-22 на 1 мм275-135 мкм1-2,5 на 1 мм2Прямоугольные, длиной 180-390 мкм,шириной 22-30 мкмТетрацитный тип, округлые, диаметром40-50 мкм23-28 на 1 мм250-65 мкм1,5-3 на 1 мм2Луковицыдлина – 120-230 мкм, ширина – 3040 мкмдлина – 110-225 мкм, ширина – 2535 мкмдлина – 130-245 мкм, ширина – 5570 мкмдлина – 120-240 мкм, ширина – 4565 мкмОкруглые, диаметром – 80-105 мкмдлина – 100-210 мкм, ширина – 20-30мкмдлина – 90-200 мкм, ширина – 18-25мкмдлина – 110-220 мкм, ширина – 50-65мкмдлина – 100-215 мкм, ширина – 30-55мкмОкруглые, диаметром –70-95 мкм85-145 мкм1,5-3 на 1 мм260-75 мкм2-3,5 на 1 мм2Округло-яйцевидные, диаметром 545 мкмКорниПервичноеТетрархный, 55-60 мкмОтсутствуетОкругло-яйцевидные, диаметром 2,2-26мкмМногоугольные округлыепрямостенные диаметром 50-70 мкм, ссосочковидными выростамиОвальные, однобороздные,гетерополярные, гладкие, длиной 18-20мкм, шириной 12-15 мкмПо строению аналогичны листуПервичноеТриархный, 45-50 мкмИмеется во внешней части коры1421Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
