Автореферат (1141248), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Установлено наличие: 1 - витамин В1 (вр. выхода1,1 мин); 2 - аскорбиновая кислота (вр. выхода 2,7 мин); 3 - галловая кислота(вр. выхода 11,8 мин); 4 - эллаговая кислота (вр. выхода 18,5 мин); 5 - рутин (вр.выхода 21,0); 6 - ксантотоксин (вр. выхода 24,0 мин); 7 - кверцетин (вр. выхода29,9 мин).Методом ВЭЖХ из травы звездчатки средней выделены флавоноидныесоединения.Методоммасс-спектрометрииустановленоиххимическоестроение. Результаты представлены на рисунке 7.20mg/ml zvezdQBA12703-Jul-2013 03:25:00DMP-030713-2 243 (2.211) Cm (239:249-250:258)OHOHO771.74651.43433.38177.040OHOOOHOOOOHOHHOOHHOOHHOOH3 C0OHHOOOOH%O771.39475.57207.26OOHOOOOHHOOHOHOH0OH1204.89HOOHOHOH1.00DMP-030713-2100OOHO0.50%1: Scan ES+1.22e6933.42100OH433.31HO313.32%OH%OHOHOH922.85 1108.351426.110OH433.38100HOOO595.44 757.39OOOHOO0OHHOOHOHOHOHOH198.24884.77Marginatoside1112.621: Scan ES+1.93e6457.31595.30955.471316.82m/z40060080010001.501.0012001400122.0e-10.02.002.503.001: Scan ES+5952.06e72.712.212.002.500.472.351.951.501.382.002.502.212.380.501.001.502.002.500.501.001.502.002.500AU758.3002001.00DMP-030713-2%173.553.001: Scan ES+4572.77e72.711.982.221.78DMP-030713-2100DMP-030713-2 148 (1.346) Cm (141:150-121:134)1001.50%%HOHO2.50DMP-030713-2100%OHO313.112.001.460.501: Scan ES+3.00e61.500.771.010DMP-030713-2 159 (1.446) Cm (154:166-170:179)3.001: Scan ES+1.43 1.784332.94e71.64 2.06 2.39 2.701.06DMP-030713-2100OOHHO0.50OOHOOHO595.58732.6801.99e62.501.450.45%100O2.001.561.00DMP-030713-2100DMP-030713-2 196 (1.783) Cm (193:200-(182:189+203:211))1.501.350.440.50OH3 C000.980DMP-030713-2 228 (2.075) Cm (225:234-211:221)1.001001260.47OHOHOHOH1: Scan ES+3132.24 2.612.843.072.20e70.98DMP-030713-2OO0.440.50O03-Jul-2013 03:25:001.46 1.78%%1: Scan ES+1.18e6933.77100%20mg/ml zvezdQBA127DMP-030713-21000.310.501.003.001: Scan ES+7573.06 1.75e73.001: Scan ES+7711.14e72.793.001: Scan ES+2.209332.16e72.43 2.703.002: Diode Array1.433352.19Range: 2.299e-11.76Time1.502.002.503.00Рисунок 7 - Результаты анализа извлечения из травы звездчатки среднейметодом ВЭЖХ/МС.Для четырех из 5-ти мажорных компонентов экстракта предполагаетсяодна из возможных структур на основании фрагментации ионов.
Показательно,что ни в одном из пиков не наблюдается фрагментация до агликона.Схема фрагментации пика с временем удерживания 1,43 мин:OHOOHOOHOOHHOOHOOOHOOHHOHOHOOOHOOHOHOOOHMarginatosideOOHOOHOOHOOHM+H=495OHOHHOOHvitexinHOOHM+H=757OHOOHOOHOHOHOHOOM+H=433CH3M+H=313OHАналогичная схема фрагментации пика с временем удерживания 1,76 мин:OHOOHOOHHOOHOOOHOOOHOHOOHOHOvitexinOHM+H=495OHOHHOOHHOOHOOM+H=433OHOCH3OHM+H=313OHДва пика с молекулярным ионом 933 отличаются только временемудерживания и совпадают по схемам фрагментации. Можно предположить, чтоструктурное различие этих соединений обусловлено различием углеводногофрагмента (включает фрагменты глюкозы, или, например, галактозы, илиположением метильной группы – при 2-ом или 3-ем остатке глюкозы, и т.д.):OHOHHOHOOOOOHHOOHHOOHOOHOHHOOHHOOHOOHOOHOHOHOH3CH3COOOHHOOHOHM+H=433M+H=771M+H=933Структура пика со временем удерживания 1,35 мин неизвестна.13OOHOHHOOOHHOOOOHOOHOOHOHOOHOOOHOOOOHСогласно данным литературы в траве звездчатки средней содержитсявитексин и его изомер сапонаретин.
Следовательно, можно предположить, чтопри фрагментации ионов пика со временем удерживания 1,43 и фрагментациипика со временем удерживания 1,76 в одном случае получается флавоноидвитексин, а в другом – изомер сапонаретин.В результате проведенных исследований из травы звездчатки среднейвыделены 5 флавоноидных соединений и установлена их химическая структура.Для количественного определения флавоноидов в траве звездчаткисреднейбылаиспользованаметодикасиспользованиемспектрофотометрического метода, указанного в разделе «объекты и методы».
Вкачестве стандарта использовали лютеолин-7-гликозид.Для расчета содержания флавоноидов был использован удельныйпоказательпоглощениялютеолин-7-гликозидаравный401,взятойизнормативной документации («Полыни горькой настойка» ФСП № 003336/01290411)Проведенастатистическаяобработкарезультатов,спомощьюразработанной методики. Ошибка единичного определения при доверительнойвероятности 0,95 не превышает ±4,5%. Отсутствие систематической ошибкидоказано опытом с добавкой лютеолин-7-гликозида.Разработанная методика использована для анализа сырья заготовленногов разных регионах России, разных органов растения, для анализа сырья наразных стадиях вегетации.
Результаты представлены в табл. 1,2,3.Таблица 1Результаты количественного определения флавоноидов в травезвездчатки средней№ Место заготовкиСодержание№п/флавоноидов, п/пп%МестоСодержаниезаготовкифлавоноидов,%1Московская обл.0,468 ±0,0216Рязанская обл.2Московская обл.0,612±0,0277Кировская обл. 0,223±0,010140,298±0,0133Московская обл.0,720±0,0328Пермский край 0,362±0,0164Пермский край0,314±0,0149Пермский край 0,451±0,0205Тамбовская обл.0,626±0,029Таблица 2Содержание флавоноидов в разных частях растения звездчатки среднейn- 5 p-0,95Содержание флавоноидов, %корнистеблиЛистьяцветки с плодами0,066±0,0010,098±0,0020,628±0,0130,106±0,002Прим. В связи маленьким размером цветков и плодов их не разделяли.Как показывают данные таблицы 2, наибольшее содержание флавоноидовв листьях звездчатки, наименьшее – в корнях.Таблица 3Содержание флавоноидов в звездчатки средней по стадиям вегетацииn- 5 p-0,95Название стадии вегетацииСодержание флавоноиодов, %Начало стадии вегетации (5-6 листочков) 0,447±0,009Начало цветения0,245±0,005Конец цветения и нач.
плодонашения0,720±0,014Из таблицы 3 видно, что наибольшее содержание флавоноидов наконечной стадии вегетации – в конце цветения и в начале плодоношения, когдадостаточно развиты листья, которые, в основном, определяют содержаниефлавоноидов в сырье.Определение углеводов и аминокислотСвободные углеводы анализировали методом прямофазной ВЭЖХ срефрактометрической детекцией. В качестве свободных углеводов в травезвездчактки содержится глицерол, глюкоза и фруктоза (табл.4).
Содержание15связанных углеводов определяли методом капиллярного электрофореза.Связанные сахара представлены арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой.5520151601080505Named-mannose-PMPglucosamine-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPtR(min)5.567.569.9111.0612.6413.5510Retention Time ( min)15Peak AreaArea Percent3.982e+617.12.435e+610.43.700e+615.94.478e+619.23.116e+613.44.294e+618.4Рисунок 8 – Хроматограмма смесистандартов.2005d-galactose-PMPd-arabinose-PMP25glucose-PMPd-xylose-PMP30d-mannose-PMP24035Response32040d-galactose-PMPd-arabinose-PMP40045glucose-PMPd-xylose-PMP480Responsedad1A.ch50glucosamine-PMPdad1A.chglucosamine-PMPd-mannose-PMPРезультаты представлены на рисунке 8 и в таблице 4.10Retention Time (min)15Хроматограмма гидролизатаNametR(min)d-mannose-PMP5.57glucosamine-PMP7.57glucose-PMP9.91d-xylose-PMP11.07d-galactose-PMP12.65d-arabinose-PMP13.53Peak AreaArea Percent2.751e+40.81.673e+648.41.038e+53.01.865e+40.57.519e+42.25.467e+41.6извлечения из травы звездчатки.Таблица 4Результаты определения свободных и связанных сахаров в травезвездчатки средней n- 5 p-0,95№Содержание свободных сахаров, %образца глицеролглюкозафруктозаобщая сумма10,130±0,0300,320±0,0060,520±0,0100,980±0,02020,150±0,0030,330±0,0070,550±0,0101,030±0,02030,110±0,0020,350±0,0070,530±0,0100,990±0,020№ Содержание связанных сахаров, %Пентозып арабиноз ксилозасумма\ ап1 2,10±0,04 0,70±0,01 2,80±0,052 2,20±0,04 0,50±0,01 2,70±0,053 2,30±0,05 0,70±0,01 3,00±0,06Гексозыглюкозагалактоза Суммаобщаясумма3,06±0,063,00±0,063,20±0,062,10±0,042,30±0,042,50±0,057,96±0,168,00±0,168,25±0,16165,16±0,105,30±0,105,25±0,1020В результате проведенных исследований в траве звездчатки установленоналичие глицерола 0,11 - 0,15 %, глюкозы 0,32 - 0,35 %, фруктозы 0,53 - 0,55 %.Общее содержание свободных сахаров 0,98 – 1,03 %.Связанные сахара в траве звездчатки представлены: арабинозой – 2,12,3%; ксилозой - 0,5-0,7%; глюкозой – 3,00-3,20%; галактозой – 2,1-2,5%.Общее содержание связанных сахаров 7,96-8,00 %.Результаты качественного и количественного определения аминокислот всырье звездчатки представлены на рисунке 9.Рисунок 9 - 1 - Хроматограмма стандартных растворов аминокислот.2 – Хроматограмма извлечений из травы звездчатки средней.Как следует из эксперимента, в траве звездчатки средней содержится 20аминокислот.Мы определили сумму свободных и связанных аминокислот.Преобладающими кислотами в траве звездчатки средней являютсяглютаминовая кислота- 21,94 %, аспарагиновая кислота- 15,45 %, пролин 10,57 %, оксилизин - 5,92 %, валин - 5,69 % от суммы свободных кислот.Определение аскорбиновой кислоты и витамина В1Определение аскорбиновой кислоты и витамина В1 проводили методомультраэффективнойжидкостнойхроматографии/масспектрометриинахроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным МС-детекторомTQD(Waters).доверительнойПоказано,вероятностичто0,95ошибканеединичногопревышаетопределения±4,52%.приОтсутствиесистематической ошибки доказано опытом с добавкой аскорбиновой кислоты.17С помощью разработанной методики были проанализированы 4 образцатравы звездчатки на содержание аскорбиновой кислоты и витамина В1.Полученные результаты представлены в таблице 5.Таблица 5Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты ивитамина В1№Площади пиков СодержаниеПлощадиСодержаниеобразцааскорбиновойаскорбиновой пиковвитамина В1,кислотыкислоты мг/% витамина В1мг/%111691552,23647111,029742543,53899911,838990238,83390210,249048540,44294012,9Из таблицы 5 видно, что содержание аскорбиновой кислоты в травезвездчатки колеблется от 38,8 до 52,2 мг/%, витамина В1 от 10,2 до 12,9 мг/%.Качественное обнаружение и количественное определениесапониновСапонины обнаруживали методом ТСХ на пластинках Сорбфил–ПТСХ–А-Ф-А-УФ в системе растворителей н-бутанол – кислота уксусная ледяная –вода (5:1:4).
В качестве стандарта использовали эсцин. Зоны адсорбциивыявляли 10 % раствором серной кислоты в 40 % этаноле при нагревании всушильном шкафу при 100 0С в течение 5 мин.На хроматограмме испытуемого раствора обнаружена зона адсорбцииэсцина с Rf 0,24 и не менее 5 зон адсорбции с Rs = 1,9; Rs = 1,6; Rs =1,0;Rs=0,67; Rs =0,41.Количественное определение тритерпеновых сапонинов проводилиспектрофотометрическим методом, описанном в разделе «объекты и методы».В качестве стандарта был использован эсцин.
При снятии спектров поглощенияэсцина и извлечения из травы звездчатки средней с кислотой сернойконцентрированной установлено, что максимум поглощения находится при18длине волны 325±3нм и что максимумы эсцина и извлечения из травызвездчатки совпадают. Результаты представлены на рисунке 10.12Рисунок 10 - спектры поглощения раствора эсцина и извлечения изтравы звездчатки средней.1 - 0,1% раствор эсцина в 95 % этаноле2 - извлечение из травы звездчатки среднейДалее с помощью калибровочного графика установлены рабочиеконцентрации, время прохождения реакции и ее стабильность, а также полнотаэкстракции сапонинов от условий экстракции и очистки сапонинов отсопутствующих веществ.Получение настоек гомеопатических матричных и ихстандартизацияСырьем для получения гомеопатических матричных настоек служила каксвежая, так и высушенная трава звездчатки средней.Настойку гомеопатическую матричную из свежего сырья готовилиспособом мацерации по методу 2а ОФС 42-0027-05 с использованием 86 %этанольного спирта (по массе), так как влажность сырья более 80 %, согласнолитературным данным сырье не содержит эфирных масел, смол и слизи.Настойку гомеопатическую матричную из высушенного сырья получалиметодом перколяции по методу 4а ОФС 42-0027-05 с использованием спиртаэтилового 62 % (по массе) или 70 % спирта этилового (по объему 1 : 10).Настойки гомеопатические матричные из свежего и высушенного сырьяимеют схожие внешние признаки:прозрачная жидкость зеленовато–коричневого цвета со специфическим запахом.19Требования к качеству сырья и настоек включены в проекты НД.Проекты НД на НГМ содержат следующие показатели: «получение»,«описание»,«подлинность»,«сухойостаток»,«плотность»,«тяжелыеметаллы», «микробиологическая чистота», «количественное определение»,«хранение», «срок годности».Определениеподлинностинастойкигомеопатическойматричнойпроводили методом тонкослойной хроматографии, по методике, описанной прианализе сырья.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
