Диссертация (1141208), страница 7
Текст из файла (страница 7)
et al., 2009), хорьки (Voter K.Z. et al., 1992) игораздо реже - более крупные животные: кролики, собаки, свиньи и коровы(Joki S., Saano V., 1994; Hoegger M.J. et al., 2013).б). Определение направления и скорости движения слизиУкрупныхлабораторныхживотных(собаки)используютсяиспользуемые в клинических исследованиях прижизненные методикиизученияперемещенияинертныхмаркеров,регистрируемыечерезбронхоскоп (King M., 1998).
Для исследования транспортной функциимерцательного эпителия слизистой оболочки полости носа in vivo Г.И.Марковым с соавт. (1996) предложена методика, основанная на определениивремени перемещения со слизью частиц древесного угля от полости носа доглотки у ненаркотизированных кроликов.При использовании мелких животных мукоцилиарный клиренсопределяется в опытах in vitro. Наиболее апробированной моделью изучениявлияния различных факторов на МЦТ является исследование скоростиперемещения частиц поверхностного слоя на изолированном участке небалягушки, культивируемого при температуре 4-6о С (Марков Г.И., 1976; FestaE.
et al., 1997). У теплокровных животных движение слизи возможнозарегистрироватьпримикроскопиикультивируемыхвнеорганизмафрагментов трахеи быков и лошадей (Wills P.J. et al., 1995; Gerber V. et al.,1997). Для определения скорости движения слизи в изолированных участкахтрахеи мышей R.J. Fransis et al., (2009) использован видеомикроскопческийанализ динамики перемещения флюоресцентных микросфер диаметром 0, 2мкм, помещенных на поверхность слизистой.Наряду с вышеописаннымиподходами, для визуализации перемещения слизи в последние годыапробируются методы конфокальной и оптической когерентной микроскопии(Huang B.K., Choma M.A., 2015).35в).
Изучение двигательной активности цилиарного аппаратаПроизводится в опытах in vitro и по технике в минимальной степениотличается от подходов, разработанных для клинической практики. Вэксперименте открывается возможность брать не только соскобы эпителия(как у человека), но и целые фрагменты воздухоносных путей на разныхуровнях, что существенно повышает репрезентативность результатов.Биоптаты помещаются в физиологический раствор или питательную среду икратковременно культивируются в контролируемых условиях (температура,влажность, рН), в этот период производится регистрация физиологическихпараметров мерцательной активности эпителиоцитов (Kawakami M.
et al.,2004; Раков А.Л. и соавт., 2000; Захарова Г.П. с соавт., 2010). Для расчетавеличинДАЦАиспользуютсяметодыфотоосциллоскопииивидеомикроскопии.Фотоосциллоскопические методы основаны на том, что синусоидальныеколебания поверхности слоя слизи, возникающие в результате биенияресничек и проявляющиеся изменениями интенсивности отражения света,направленногонаповерхностьслизистойоболочки,регистрируютсяфотодетектором (или телекамерой), полученные сигналы преобразуются визображениенаэкране,осциллограммыкалькулируютсяметодомспектрального анализа. Впервые данная методика, предложенная T. Dalhamn& R.
Rylander (1962), впоследствии модифицирована J. Yager et al., (1980) и S.Joki, V. Saano (1995). Существенным недостатком данного подхода являетсянедостаточно высокая чувствительность, не позволяющая верифицироватьтонкие изменения параметров в норме и патологии (Кобылянский В.И., 2008).Последующее развитие техники визуализации и компьютерного анализаизображений позволило разработать прямые методы изучения ДАЦА наоснове метода ускоренной видеосъемки (Riechelmann H. et al., 1995). Вкачествепримераиспользованиятакогоподходаможнопривестиисследование В.В.
Шабалина и Г.П. Захаровой (1997). Запись изображения36движущихся ресничек осуществлялась на компьютере с частотой кадров 25кадров/сек. при общем увеличении установки ×4500. Во время обработкивидеоизображения из первого полного видеокадра выделяли «областьинтереса» с работающими ресничками, и последующая обработка по всемкадрам выполнялась только в рамках этой области. Весь видеофайл разрезалина отдельные кадры, включающие только эту «область интересов»; обработкавидеозаписей проводилась в режиме ручных измерений, в результате чего вразные моменты времени фиксировались положения отдельных ресничек.
Придостаточной информативности и точности данный метод оказался достаточнотрудоемким. Усовершенствованный подход на основе метода ускореннойвидеосъемки с применением высокоскоростной цифровой камеры (до 200кадров в секунду) использован при изучении изолированной трахеинеонатальных мышей (Fransis R.J. et al., 2009) и новорожденных свиней(Hoegger M.J. et al., 2013). Расчет ЧБР производился на основании оценкичислафреймов,захватывающихполныйциклбиенияресничкиипродолжительности одного фрейма.В последнее десятилетие для измерений ДАЦА в ринологическойпрактикеразработаныпрограммно-аппаратныекомплексына основеиспользования высокоскоростных (до 100 кадров в секунду) аналоговых илицифровых видеокамер, сопряженных с микроскопом и соответствующегопрограммного обеспечения (Алексеев Д.С. с соавт., 2005) .
Качественно новыерезультаты дало внедрение методов компьютерного спектрального анализацифровых видеофайлов на основе одномерного временного преобразованияФурье (Алексеев Д.С., Попечителев Е.П., 2012). Полученные подходыуспешно апробированы в ринологических исследованиях (Козлов В.С. ссоавт., 2005; Крамной А.И., 2008) и являются весьма перспективными припроведении экспериментальных исследований.г).
Комплексные подходы к экспериментальному изучению функции МЦТ37K.T. Morgan et al., (1984) предложили способ регистрации движенияслизи и частоты биения ресничек на разных полях слизистой оболочки носакрыс без извлечения слизистой на нативном препарате сагитального разрезаголовы крысы. Однако подготовка полей, картирование слизистой оболочкиноса для изучения с помощью световой микроскопии и видеофиксацииоказалась весьма трудоемкой и не вполне точной.Комплексныйподходкизучениюмукоцилиарногоклиренса(видеомикроскопия в сочетании с фотоосциллографией) использован V.Gerber et al., (1997) при изучении культивируемых вне организма фрагментовтрахеи быков.Возможность одновременного определения величин ЧДС иЧБР на препаратах изолированной трахеи или легкого мышей с помощьюметода ускоренной видеосъемки продемонстрированы H. Kurosawa et al.,(1985); R.J.B.
Fransis et al., (2009).L. Liu et al., (2013) предложен новый комплексный подход кприжизненному количественному изучениюin vitro функциональноймикроанатомии воздухоносных путей на основе применения оптическойкогерентной томографии с высоким разрешением. Данная методика,апробированная на первичной культуре бронхиальных клеток человека итканевых эксплантатах трахеи мышей, позволяет рассчитать основныеколичественные параметры поверхности воздухоносных путей (толщинаперицилиарного слоя, частота и фазовый анализ биения ресничек, скоростьдвижения слизи).2.5.2.
Возрастные и региональные особенностиа). Возрастные особенности МЦТУ человека данный аспект изучен преимущественно на эпителиальнойвыстилки нижней носовой раковины. Средняя частота мерцания ресничекэпителия у новорожденных детей in vitro составила 12,7 Гц, что выше (11, 138Гц) чем у взрослых людей (O'Callaghan C., Smith K., 1991). Средняя частотамерцания ресничек эпителия носовой полости в детской популяции средиздоровых лиц в 11 лет (12,8 Гц) выше, чем во взрослой (11,5 Гц, 40 и болеелет); при этом у 10% здоровых детей отмечаются участки слизистой сдискинезией мерцания ресничек (Chilvers M.A., Rutman A., 2003).
По даннымJ.C. Ho, K.N. Chan (2001) по сравнению с молодыми субъектами в возрасте 4060 лет обнаружено снижение частоту мерцания ресничек (с 13,6 до 12,4 Гц) изначительно более высокий процент тубулопатий (единственная центральнаямикротрубочка). В то же время в возрасте 70-90 лет частота мерцанияресничек сохранялась на достаточно высоком уровне (12, 1-13 Гц).D.R.Edelstein (1996) изучал закономерности изменения строения ифункции носа у взрослых людей по мере их старения, в качестве одного изпараметров была выбрана частота мерцания эпителиальной выстилки.Показано, что с возрастом данный показатель людей существенно неизменяется и колеблется в диапазоне от 12,5 Гц в 20-29 лет до 13,3 Гц в 80 лети старше. Однако по данным E.
Puchelle, J.M. Zahm, (1979); H. Matthys (1983),К.Н. Ruble, (1983) мукоцилиарный клиренс на 36% ниже у пожилых (>54 лет)субъектов, чем у молодых обследуемых. В то же время C.H. Kao, R.S. Jiang(1994) в своих исследованиях, наоборот, указывают на статистическинедостоверную связь (р>0.05) возраста и скорости мукоцилиарноготранспорта (4.8 +/- 1.9 мм/мин у людей 60 и более лет и 4.4 +/- 2.7 мм/мин уболее молодых испытуемых).Впервыерегистрируетсясуткипостнатальногонаибольшаячастотаонтогенезамерцаниявтрахеересничекмышей(23,4Гц),направленное движение слизи у крыс и мышей отсутствует (Voter K.Z., LeighM.W., 1992; Francis R.J.
et al., 2009). Спорадический и очень медленный МЦТвпервые регистрируется на 6-9 день после рождения, а к 28 днюпостнатального онтогенеза он достигает уровня взрослого организма (10,7+/3,7 мм/мин). По мнению авторов, возникновение движения слизи в трахее39значимо коррелирует с рядом возникающих к этому возрасту событий:увеличение площади поверхности эпителиальной выстилки, покрытоймерцательными клетками в трахеи до 25-35%; изменения в характеремерцания, секреции слизи, ионной проницаемости и транспорта.Средняя частота мерцания для 3-хмесячных крыс составила 6-18 Гц наразных полях слизистой оболочки носа, и 6-12 Гц в трахее (Morgan K.T. et al.,1984; Kawakami M. et al., 2004).В возрастной динамике морских свинок от 0,9 до 16,3 месяцев, частотабиения ресничек снижается с 20.2 до 6,9 Гц (Joki S., Saano V., 1997).Для установления механизма замедления ЧБР с возрастом былаопределена активность протеинкиназы С (РКС) в эпителии трахеи мышей.
Небыло выявлено различий в активности PKC-α у животных в возрасте 2, 12 и 24мес. Активность PKC-ε, оказалась значительно более высокая у мышей в 12 и24 мес., по сравнению с 2-хмесячными животными. Для подтверждения связимежду активацией РКСε и замедлением движения ресничек на трахею 2-хмесячныхмышейподействовалиPKCε-агонистом.Былополученоаналогичное снижение базовых показателей частоты биения ресничек (BaileyK., Bonasera S.J., 2014).По данным S.L. Whaley, B.A. Muggenburg (1987) средняя величинаскорости движения слизи в трахее у собак составила:o у неполовозрелых особей -3.6 +/- 0.4 мм/мин.,o у молодых половозрелых животных - 9.7 +/- 0.6 мм/мин.,o у животных средней возрастной группы 6.9 +/- 0.5 мм/мин.,o у зрелых животных - 3.5 +/- 0.8 мм/мин.,o у животных с выраженными старческими изменениями 2.9 +/0.5 мм/мин.40Таким образом у молодых и животных средней возрастной группы скоростьдвижения слизи оказалась значимо выше (р<0,05), чем у зрелых, пожилых истарых особей.б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
