Диссертация (1141208), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Наосновании этого рассчитывается скорость прохождения частицами маркераучастка трахеи длиной 5-7 мм. Исследование двигательной активности цилиарного аппарата in vitroОрганизация эксперимента В основу предлагаемых подходов кисследованию ДАЦА в эксперименте на белых крысах положена методикапрямой видеорегистрации, применяемая для изучения биоптатов эпителияносовой полости у человека (Алексеев Д.С. с соавт., 2005). Для проведенияисследований использован программно-аппаратный комплекс НПО «Азимут»(г.Санкт-Петербург), включающий в себя микроскоп ЛОМО Микмед-6 стермостоликом, высокочастотную аналоговую видеокамеру Эндокам-600К,компьютер с платой захвата высокочастотного видеосигнала Raster RT851 испециальное программное обеспечение MOSFRO для измерения частотыбиенияколеблющихсяобъектов(рис.3,а).Электронныйблоктермостатирования обеспечивает регулировку и поддержание стабильнойтемпературы 32±0,5°С как биоптата в процессе микроскопии (термостоликмикроскопа), так и инструментария, предметных и покровных стекол, сосудовс питательной средой (отдельный термостатируемый столик, рис.3,б).Использование высокочастотных камеры и платы видеозахвата позволяетпроводить черно-белую запись изображения с частотой до 80 кадров всекунду.4823451aб21вРис.3.
а - система наблюдения и регистрации ДАЦА: 1 – термостоликмикроскопа, 2 – скоростная видеокамера, 3 – монитор для выводаизображения, 4 – блок терморегуляции, 5 – системный блок компьютера. б –термостолик для подготовки инструментов и растворов с питательной средой.в - фрейм видеофайла: 1 – мерцательные клетки, 2 – мерцательные реснички,кружки – идентификационные точки, нанесенные на ресничку (стрелки).49Создание видеофайлаПосле завершения съемки движения слизи пооткрытому фрагменту трахеи производится забор поперечного среза кольцатрахеи толщиной до 1 мм, смежного с открытым участком (Рис.1, в) ипомещениезаполненногоеговлункообразноесредой Игла МЕМуглублениепредметногостекла,и предварительно нагретого натермостолике до 32ºС. Остальная часть трахеи помещается в фиксирующуюсреду (забуференный формалин, жидкость Буэна) для последующегогистологического и гистохимического изучения (Рис.1, г).Биоптат накрывают тонким покровным стеклом и помещают подобъектив микроскопа х100 (масляная иммерсия), после чего производитсяпоиск зоны с четкой видимостью движущихся ресничек мерцательногоэпителия.
Изображение воспроизводится на мониторе компьютера в режимереального времени. После нахождения одной из зон объекта при суммарномувеличении х1000 (об.100, ок.10) осуществляется захват сфокусированногоизображения с последующим сохранением видеофайла (продолжительностьзаписи одного фрагмента составляет 10-12 сек.). От одного образцазаписывается не менее трех видеофайлов. Общая продолжительность данногоэтапа – до 10-15 мин. в расчете на 1 животное.Математическая обработка Подсчет частоты биения ресничекпроводится при помощи специальной компьютерной программы MOSFRO.Последняя позволяет воспроизводить всю запись, проводить покадровыйпросмотр, произвести подсчет частоты колебаний, а также рассчитатьсоотношение фаз мерцания ресничек, представленных в видеофрагменте.
Длявыполнения подсчета частоты колебаний ресничек и их фаз движения намонитор выводится начальный фреймизучаемого видеофрагмента. Намониторе четко визуализируются реснички эпителия, на которые при помощикомпьютерной мыши наносятся идентификационные точки (рис.3, в). Послезапуска видеофайла программа фиксирует изменение яркости в этих точках ирассчитывает частоту колебаний объектов в Гц. Кроме того, при нанесении50точек на основание и конец реснички автоматически рассчитывается высотапоследней. Все полученные результаты сохраняются в электронной базеданных, что позволяет наблюдать динамику изменения характеристикобъектов и проводить статистический анализ.Предлагаемый алгоритм изучения гистофизиологии эпителиальнойвыстилки трахеи позволяет за короткий период времени (20-30 мин.
в расчетена одно животное) прижизненно зарегистрировать и задокументировать вцифровой форме изученные процессы и провести взятие материала длягистологического анализа стенки органа. Даннаяпродолжительностьэксперимента не влияет на изменение показателей МЦТ и ДАЦА, чтопредварительно установлено в процессе отработки методик.
Описанныеподходы обеспечивают достаточно высокую воспроизводимость результатов(величины коэффициентов вариации изученных функциональных показателейв возрастных группах из 7-10 интактных животных не превышают 10-12%) ипозволяют с максимальной эффективностью и информативностью провестикомплексный морфо-функциональный анализ исследуемого объекта.Гистологическое исследованиеФрагменты трахеи, иссеченные во время прижизненных наблюдений изкраниальных и каудальных отделов, фиксировали по Буэну и заливали впарафин; срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином с эозином иреактивом Шиффа с подкраской гематоксилином (ШИК-реакция) и 0, 1%альциановым синим.Морфометрические исследованияСредние значения высоты реснитчатых клеток (ВРК) и длины ихресничек (ДР) у каждого животного определяли на основании измерений спомощью винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15х (ОАО «ЛОМО», Россия)при иммерсионном увеличении микроскопа (об.90).51Для обеспечения воспроизводимости количественных данных отдельнобыли проанализированы особенности структуры и функции эпителиальнойвыстилки трахеи на поперечных срезах органа.С учетом, что на поперечных срезах трахеи при микроскопии можнонайти визуальные различия в выраженности развития слизистой оболочки вдорсальном, вентральном и латеральных отделах, проведено изучение частотыбиения ресничек, высоты реснитчатых клеток и длины ресничек всоответствующих отделах трахеи 7 животных репродуктивного возраста (6мес.).
Результаты измерений приведены в таблице 2. Достоверных различийЧБР и ДР между изученными отделами не выявлено. В то же время ВРК вдорсальном отделе оказалась в среднем на 20% выше, чем в других участках.Поэтому ВРК на каждом срезе измеряли в 5 равномерно распределенных попериметру точках (с обязательным включением дорсального отдела) ирассчитывали среднее значение показателя.Таблица 2.Количественные показатели строения и функции эпителиальной выстилки ввентральной, дорсальной и латеральных частяхпериметра кольца трахеи крыс репродуктивного возраста (Х + sx )Отделы трахеиПоказательдорсальныйвентральный латеральный латеральный(п)(л)1. ЧБР, Гц13,0 ± 0, 213, 1 ± 0,411,9 ± 0,412,8 ± 0,32.
ВРК, мкм24,8 ± 1,020,5 ± 1, 1 120,3 ± 0,5 120,8 ± 0,9 13. ДР, мкм4,0 ± 0, 24,0 ± 0,43,8 ± 0, 24, 1 ± 0, 2Примечания:1– р < 0,05 по сравнению с дорсальным отделом, п – правый, л –левый латеральные отделы.52Частоту основных типов эпителиальных клеток в пласте определяли впроцентах на основании подсчета 1-2 тыс. эпителиоцитов по всей внутреннейповерхности пласт у животного с помощью прикладной компьютернойпрограммы «Универсальный гистологический счётчик», разработанной накафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ЯГМУ (К.Г.Кемоклидзе, 2012).Программа позволяет исследователю при просмотре гистологическогопрепарата, не отрывая взгляд от окуляра микроскопа или изображения наэкранемонитора,регистрироватьнеобходимыепараметры,которыеавтоматически суммируются в виде итоговых данных с одновременнымрасчетом основных статистических параметров выборки (средняя величина,квадратическое отклонение [ошибка средней]).Площадь внутренней выстилки трахеи (S) рассчитывали на основаниилинейных измерений внутреннего диаметра (D) и расстояния междухрящевыми кольцами (L) на фреймах видеофайлов, полученных приизмерении скорости движения слизи in vivo (рис.4).
На центральные участкипоперечно срезанных хрящевых колец на границе с внутренним просветоморгана наносили идентификационные точки, после чего проводили линейныеизмерения. Средние значения обоих показателей у каждого животногоопределяли на основании измерения 5 хрящевых колец.Внутреннюю площадь трахеи определяли по формуле площади боковойповерхности цилиндра:S = π х D х h,где D – диаметр, h – высота цилиндра, рассчитанная по формуле:h = L х (n – 1),гдеL - среднее расстояние между хрящевыми кольцами, n – число колец втрахее; для крыс n = 30 (Западнюк И.И.
с соавт., 1974).Среднее время обновления слизи (Т)рассчитывали как время,необходимое для прохождения маркера по всей длине трахеи:T = h х СДС .53LDРис.4. Схема линейных измерений на видеофайлах продольносрезанной трахеи. Стрелки – идентификационные точки на внутреннейповерхности поперечных срезов хрящевых колец, D – внутренний диаметртрахеи, L –расстояние между соседними хрящевыми кольцами.Статистическуюобработкуполученногоцифровогоматериала(вариационная статистика, корреляционный и регрессионный анализ)проводили с использованием прикладных программ BIOSTAT и Statistica 8.Объективная периодизация постнатального развития мукоцилиарногоаппарата производилась путем центрирования выровненных кривых с последующим вычислением коэффициента вариации (Cv) центрированных ординатаппроксимирующих значений изученных показателей в каждой временнойточке; сроки, соответствующие наиболее резким изгибам полученнойинтегральной кривой, принимали за границы периодов (Катинас Г.С., БыковВ.Л., 1976).544.
ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ МУКОЦИЛИАРНОЙ ТРАНСПОРТНОЙСИСТЕМЫ ТРАХЕИ КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ4.1. Микроскопическое строение4.1.1. Эпителиальная выстилкаТрахея новорожденных крыс выстлана двухрядным эпителием, всоставе которого обнаруживаются реснитчатые и базальные клетки (рис.5, а),однако преобладающим типом являются эпителиоциты без признаковспецифическойдифференцировки(рис.5,б).Средипоследнихобнаруживаются клетки, в апикальных участках которых накапливаютсяШИК-позитивные гранулы, по всей вероятности, это предшественникибокаловидных экзокриноцитов (рис.5, в). В течение последующих 2 недельколичество реснитчатых клеток в пласте существенно возрастает (рис.6, а),часть недифференцированных элементов активно делится митотически (рис.6б,в), к 21 дню эпителий приобретает многорядную структуру (рис.6, г).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
