Автореферат (1139933), страница 3
Текст из файла (страница 3)
МСК КМживотных ферментативно диссоциировали с помощью добавления коллагеназы IIтипа (Gibco) до конечной концентрации 0.075% в течение 60 мин при температуре370 С. Затем коллагеназу инактивировали с помощью равного объема полнойпитательной среды DMEM/F12 (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьейсыворотки (HyClone), 2 ммоль/л L-глутамина и 100 Ед/мл Стрептомицина(Invitrogen). Полученную суспензию центрифугировали в 15 мл культуральнойсреды, производили посев первичной культуры клеток на культуральный флакон(25см2, Corning) инкубировали при температуре 370С в атмосфере, содержащей 5%СО2 с повышенной влажностью.
Клетки пассировали с помощью 0.25% р-ратрипсина/EDTA (Gibco). Питательную среду заменяли дважды в неделю. МСК КМвторого пассажа забирали для участия в дальнейшем эксперименте (рисунок 2, 3).Оценка получения ТИК производилась на 3, 6, 14 сутки (рисунок 4 А, Б, В).Рисунок 2 - Первичная культура МСК КМ интактных крыс (5-е сутки культивирования). Ув. ×200,фазовый контраст.АБРисунок 3 - Культура МСК КМ интактных крыс: А. – первый пассаж (10-е суткикультивирования).
Б. – второй пассаж (14-е сутки культивирования). Ув. ×200, фазовый контраст.АБВРисунок 4 - Сетка полипропиленовая с МСК КМ крысы: А - 3 сут. после нанесения. Стрелкауказывает на адгезивную клетку. Ув. × 200, фазовый контраст. Б - 6 сут. после нанесения. Ростклеточной культуры продолжается, клетки почти полностью покрыли поверхность нитей. Ув. ×200, фазовый контраст. В - 14 сут. после нанесения.
Стрелка указывает на закрытие ячейкимонослоем клеток. Ув. × 40, фазовый контраст.Оценка жизнеспособности клеточного покрытия на сетчатых матриксахпроизводили на 27 сутки при помощи окраски LIVE/DEAD (рисунок 5).12Рисунок 5 - Сетчатый имплантат с МСК крысы, 27 сут.
культивирования. Конфокальнаямикроскопия. В фокусе – одна плоскость.Имплантация контрольных сеток и ТИК с аутологичными МСК КМ крыспроводиливобразованные«карманы»подапоневротическоепространствопередней брюшной стенки 12 крыс (рисунок 6).Рисунок 6 - Установлены две хирургические сетки на равном расстоянии от белой линии живота:слева – хирургическая сетка без нанесения МСК КМ крысы, справа – хирургическая сетка снанесенными МСК КМ крысы.Полное заживление послеоперационного шва наступало в среднем к 10-15суткам. Животных выводили из эксперимента через 2 месяца (4 крысы) и 4,5месяца (8 крыс).В результате гистологического исследования была проведена сравнительнаяхарактеристика степени зрелости соединительной ткани и возникновения лимфомакрофагальной инфильтрации на имплантацию контрольной ППС (рисунок 7 А,Б) и ТИК (рисунок 8 А, Б), покрытой МСК КМ на её основе.АБРисунок 7 - Контрольная полипропиленовая сетка. А - 2 мес.
Небольшой лимфо-макрофагальныйинфильтрат в соединительной ткани. Окраска ГЭ, х 400. Б - 4.5 мес. Отёк и воспалительнаяинфильтрация соединительной ткани вокруг сетки. Окраска ГЭ, х 200АБРисунок 8 - Опытная сетка (полипропиленовая сетка с нанесенными МСК КМ крысы): А - 2 мес.Макрофагально-нейтрофильная инфильтрация в соединительной ткани. Окраска ГЭ, х 400. Б - 4,5мес. Уплотнённая и рыхлая соединительная ткань вокруг сетки. Слабая воспалительная реакция.Окраска ГЭ, х 200.13Тканевую реакцию организма на имплантацию ТИК с МСК КМ крысы иконтрольную ППС без клеточного компонента оценивали балльной шкале.Результаты отражены в таблице 1.Таблица 1Сравнительная оценка тканевой реакции на имплантацию крысе ТИК с МСККМ и полипропиленовой сеткиБиорезорбцияМакрофагальная реакцияТоксические свойстваИммунореактивностьАнгиогенезМикрососудистыеповрежденияФормирование капсулыТИК (полипропилен +МСК КМ)342,38±0,484±0,824,5±0,583±0,82Полипропиленовая сетка44242,33±0,584,33±0,584,67±0,583±1У ТИК на ППС с МСК КМ получили следующие индексы: ИП – 11,5±0,58;ИВ – 9.38±0,71; ИР – 1,23.
У ППС получили следующие индексы: ИП –10,67±0,58; ИВ – 9.66±0,72; ИР – 1,1.Вывод: применение аутологичного клеточного компонента увеличиваетпролиферативную и регенеративную активности при имплантации сетчатогоэндопротеза.На втором этапе исследования в качестве клеточного компонентаиспользовали ДФ, полученные при заборе эпидермиса кожи размером 5х5 мм улабораторных крыс Вистар (рисунок 9).Рисунок 9 - Первичная клеточная культура дермальных фибробластов крысы (1-е суткикультивирования).
Ув. ×200, фазовый контраст.На втором этапе проводили сравнение динамики образования ТИК наразличных матриксных поверхностях: полипропиленовая (рисунок 10), титановая(рисунок 11), викриловая (рисунок 12), композитная (рисунок 13) сетки,биологический имплантат (рисунок 14). Контроль проводился на 3, 5, 14, 30 сутки.14АБГВРисунок 10 - Сетчатый полипропиленовый имплантат с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки послеимплантации, стрелка указывает на отдельные адгезирующие клетки на поверхности нити. Ув. ×100, фазовый контраст.
Б – 5 сутки, стрелки указывают на частично покрытые поверхностью нити.Ув. × 100, фазовый контраст. В – 14 сутки, полное покрытие нити полипропиленовой сети. Ув. ×200, фазовый контраст. Г- 30 сутки, стрелка указывает на полное закрытие мелкой ячейки. Ув. ×100, фазовый контраст.АБГВРисунок 11 - Титановая сетка с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки после имплантации, стрелкауказывает на адгезирующую клетку на поверхности нити. Ув.
× 100, фазовый контраст Б – 5 сутки,стрелки указывают на множественные адгезирующие клетки на поверхности нити. Ув. × 100,фазовый контраст. В – 14 сутки, стрелка указывает на размножающиеся клетки в углу междунитями. Ув. × 200, фазовый контраст. Г- 30 сутки, стрелка указывает на полное закрытие мелкойячейки. Ув.
× 100, фазовый контраст.ВБАРисунок 12 - Викриловая сетка с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки после имплантации, стрелкауказывает на адгезирующую клетку на поверхности нити. Ув. × 100, фазовый контраст Б – 5 сутки,стрелки указывают на множественные адгезирующие клетки на поверхности нити. Ув. × 100,фазовый контраст. В – 14 сутки, стрелка указывает на размножающиеся клетки в углу междунитями. Ув. × 200, фазовый контраст.АВБГРисунок 13 - Композитная сетка с ДФ кожи крысы Вистар: А – 3 сутки после имплантации,стрелка указывает на адгезирующую клетку на поверхности нити. Ув. × 100, фазовый контраст Б –5 сутки, адгезирующие клетки на в толще волокон нити. Ув.
× 100, фазовый контраст. В – 14сутки, стрелка указывает на размножающиеся клетки между волокнами нити. Ув. × 200, фазовыйконтраст. В – 14 сутки, клетки покрыли все волокна нитей, переходят на соединения нитей вуглах. Ув. × 200, фазовый контраст.15Рисунок 14 - Биологический имплантат с ДФ кожи крысы Вистар: 30 сутки после нанесенияклеток на поверхность, образование нескольких слоев клеток. Ув. × 100.Подтверждение первоначального обрастания поверхностей нитей ДФ сдальнейшим заполнением ячеек сеток выполняли при помощи конфокальноймикроскопии (рисунки 15, 16, 17).Рисунок 15 - Сетка полипропиленовая, нить покрыта живыми ДФ крысы, 12 сут. культивирования.Конфокальная микроскопия. Окраска LIVE/DEAD.АВБРисунок 16 - 30 сутки культивирования ДФ на матриксах: А - полипропиленовая сетка,оставшаяся незакрытой ячейка сетки с живыми ДФ, расположенными в несколько слоев; Б –титановая сетка, покрытые нити сети живыми ДФ; В – биологический имплантат, пророщенныйДФ.
Конфокальная микроскопия. Окраска LIVE/DEAD.АБРисунок 17 - 45 сутки культивирования: многослойная ткань, состоящая из ДФ и армирующихсеток, и биологических имплантатов: А- полипропиленовая сетка; Б –биологический имплантат.Конфокальная микроскопия. Окраска LIVE/DEAD.Во время проведения второго этапа исследования имплантацию полученныхТИКпроводилиподсобственнуюфасциютрапециевидноймышцывподлопаточную область (рисунок 18).Рисунок 18 - Имплантация готовых ТИК в образованные «карманы» в межлопаточной области подсобственную фасцию трапециевидной мышцы.Тканевая реакция оценивалась в контрольные сроки – 7, 14 и 21 сутки(рисунки 19, 20, 21, 22, 23).16Рисунок 19 - ТИК на основе полипропиленовой сетки с ДФ крысы, 21 сутки.
Наименеевыраженная клеточная реакция, достаточное полнокровие капилляров, менее выраженный отекокружающих тканейРисунок 20 - ТИК на основе титановой сетки с ДФ крысы, 14 сутки. Количество сосудовзначительно меньше по сравнению с 7 сутками. Сформированный трабекулярный каркас изволокон соединительной ткани с отсутствием каких-либо воспалительных измененийРисунок 21 - ТИК на основе викриловой сетки с ДФ крысы, 21 сутки. Вокруг нитей сеткиобразуется фиброзная ткань, формирующая единую плотную структуруРисунок 22 - ТИК на основе композитной сетки с ДФ крысы, 14 сутки.
Сформироваласьпсевдокапсула вокруг имплантируемого материала, представленная молодой соединительнойтканью из коллагеновых волокон и фибробластно-коллагенового каркаса вокруг сеткиРисунок 23 - ТИК на основе биологического имплантата с ДФ крысы, 21 сутки.Неоваскуляризация имплантата, активность воспалительной реакции соответствует нормальномутечению раневого процессаБионедеградируемая полипропиленовая сетка на сроках контроля (7, 14, 21сутки) показала снижение активности пролиферации. На 7-е сутки индекс Ki-67составил 30%, к 14-м суткам отмечалось постепенное снижение пролиферации до20%, а на 21 сутки – на уровне 10%.
Данные показатели отразили наименеевыраженнуюактивностьорганизмакрысынавнедрениеТИКнаполипропиленовой матрице (рисунок 24 А). Индекс Ki 67 на имплантацию ТИК наоснове биологического имплантата с аутологичными ДФ к 21 суткам составил17лишь 25%, что отражает умеренную пролиферативную активность клеток крысы навнедрение конструкции (рисунок 25 Б).БАРисунок 24 - Иммуногистохимическая реакция с антителами к антигену Ki-67 на 21 сутки: А –ТИК на полипропилене, Б – ТИК на биологическом имплантате. Ув. ×100.Получены схожие результаты уровня активности маркёра Bcl2 по всемвидам матриксов для ТИК.
На 7-е сутки выявляется мембранное окрашиваниеэндотелиальных клеток и максимальная экспрессия Bcl2. К 14 суткам происходилоумеренное снижение экспрессии Bcl2. К 21 суткам отмечено снижение Вcl2экспрессии, вплоть до полного исчезновения экспрессии Вcl2. Однако, у ТИК наоснове полипропиленовой сетки – уровни активности на 14 и 21 сутки остаютсяодинаковыми, что говорит о отсутствии выраженной гибели дермальныхфибробластов на поверхности матрикса (рисунок 26).Рисунок 26 - Иммуногистохимическая реакция с антителами к Bcl2: участок ТИК на основеполипропиленовой сетки с аутологичными ДФ крысы с окружающими тканями на 21 сутки послеимплантации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
