Автореферат (1139675), страница 4
Текст из файла (страница 4)
По результатам исследованияполучено 2 патента на изобретение Российской Федерации.Структура и объем диссертацииДиссертационная работа представлена в виде рукописи, имеет следующую структуру:титульный лист, оглавление, введение, обзор литературы, описание материалов и методовисследования,9главсобственныхисследований,заключение,итогивыполнениядиссертационной работы, выводы, перспективные направления дальнейшего развития темыдиссертационного исследования, практические рекомендации, список сокращений и условныхобозначений, список литературы. Работа выполнена печатным способом на 429 страницах.Список литературы содержит 535 литературных источников: 174 – отечественных и 361 –зарубежный.
Работа оформлена с использованием109 таблиц, 29 рисунков и 25 схем.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы диссертационного исследованияДля достижения цели и решения поставленных задач использовались классические имодернизированные методы органического синтеза. Строение, индивидуальность соединений,полученных при выполнении химического эксперимента доказаны с использованиемсовременных методов физико-химического и спектрального анализа, включая УФ-, ЯМР 1Нспектроскопию, ИК, масс-спектрометрию, ТСХ (тонкослойная хроматография), элементныйанализ. Названия енаминам, амидам, пирролохинолонам даны по правилам компьютернойпрограммы ACDLABS IUPAC Name Generator, структурные формулы соединений нарисованыв компьютерной программе ISIS Draw 2,4.Для прогноза потенциальной фармакологической активности и токсичности (наличие(Pa)илиотсутствие(Pi))использовалась13компьютернаясистемапрогнозированиябиологической активности веществ PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) на основеанализа так называемых обучающих выборок, содержащих десятки тысяч молекулорганических веществ различных химических классов, проявляющих множество видовбиологической активности [Филимонов Д.
А., Поройков В. В., 2006; Varnek A., 2008;Филимонов Д. А. и др., 2014]. В работе мы использовали версию 9.1, зарегистрированную в2007 году.Для изучения чувствительности микроорганизмов к полученной серии синтетическихсоединений, согласно общепризнанным в фармакологии и микробиологии принципам поиска идоклинического исследования противомикробных свойств новых соединений, использовалисьметод серийных разведений в бульоне (макрометод «пробирочный») и диско-диффузионныйметод (ДДМ) [Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985г.; СП 1.2.036-95; ФЗ от 30.03.99 N 52-ФЗ;СП 1.3.2322-08; МУК 4.2.1890-04; Миронов А.
Н. и др., 2012; Козлов Р. С. и др., 2018].В качестве тест-микроорганизмов для изучения противомикробной активностиисследуемых соединений использовали музейные штаммы: Staphylococcus aureus 25923 АТСС,Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р, Staphylococcus aureus 43300 АТСС (MRSA), Staphylococcusaureus 906, Escherichia coli 25922 АТСС, Pseudomonas aeruginosa 27853 АТСС, Streptococcuspyogenes 1238 АТСС, Streptococcus pyogenes 19615 АТСС, Streptococcus pneumoniae 49619 ATCC,Salmonella enteritidis 5765 ATСС, Shigella sonnei S-форма, Pseudomonas aeruginosa 453,Escherichia coli М-17, Enterococcus faecalis 19433 АТСС, Citrobacter freundii 101/57, Proteusvulgaris «Цветков», Klebsiella pneumoniaе 13883 АТСС, Bacillus cereus 96, Mycobacteriumtuberculosis (музейные штаммы, используемые в работе, получены из коллекции музея живыхкультур ФГУН «ГИСК им.
Л. А. Тарасевича», ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» МинздраваРоссии, ФБУН «ГНЦ ПМБ» («ГКПМ – Оболенск»), Becton Dickinson France S.A.S.),Mycobacterium tuberculosis (клинический штамм, чувствительный к противотуберкулезнымпрепаратам).В качестве опытных исследовались штаммы микроорганизмов (n=3150) изолированныеиз материала, взятого от больных с неспецифическими и специфическими заболеваниямиорганов дыхания и мочевыводящих путей, кишечника с различной чувствительностью ктрадиционно применяемым антимикробным препаратам.Источником выделения патогенов служила моча, мокрота, слизь из зева, носа иносоглотки, отделяемое ран, фекалии, секционный материал.
Верификацию лабораторныхштаммов микроорганизмов проводили бактериологическими методами по классическойметодике [Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985г.]. Окончательную идентификацию иопределение чувствительности микроорганизмов к традиционным антимикробным препаратампроводили с помощью автоматической бактериальной системы «Sensititrе» (UK).14ДляопределениячувствительностиMycobacteriumкtuberculosisизучаемымсоединениям использовали метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена[Федеральный закон от 30.03.99 N 52-ФЗ; СП 1.3.2322-08; СП 1.2.036-95].Для исследования острой токсичности в работе изучали действие исследуемыхсоединений, проявляющееся после их однократного применения.
Острую токсичностьопределяли с использованием лабораторных животных (мыши и крысы) при различных путяхвведения (внутрибрюшинное, внутрижелудочное, накожное). Основные параметры остройтоксичности изучаемых соединений среднелетальные дозы LD50, LD16, LD84 вычислялись спомощью метода Литчфилда и Уилкоксона [Миронов А. Н. и др., 2012].Для выделения наиболее перспективных фармакологических агентов по совокупности иоптимальному сочетанию критериев противомикробной активности и безопасности в работеиспользовались функциональные возможности метода бинарной логистической регрессии,который позволяет учесть вклад отдельных факторов в формирование общего эффектакандидата в лекарственное средство [Миронов А.
Н. и др., 2012].Для определения типа противомикробного действия использовали методику проведенияопытов при воздействии исследуемых соединений в физиологическом растворе при комнатнойтемпературе и коротких экспозициях [Першин Г. Н. и др., 1975; Миронов А. Н. и др., 2012). Типдействия исследуемых соединений подтвержден, разработанным в ходе исследования, новымспособомопределенияантимикробнойтипаактивностьюпротивомикробногодействияпротивомикробного[Заявкадействиянаизобретениесоединений,обладающихсоединений,«Способобладающихопределенияантимикробнойтипаактивностью»,регистрационный номер: 2018128308; 2018].Для оценки SOS-индуцирующей активности исследуемых соединений использован SOSхромотест [Quillardet P. et al., 1982; Миронов А.
Н. и др., 2012]. SOS-хромотест рекомендовандляизучениямеханизмаантибактериальногодействия,основанногонавоздействиеисследуемых соединений на ДНК. SOS-система прокариот – это защитная система бактерий,которая активируется в ответ на серьезные повреждения ДНК или ингибирование репликации изапускает цепь защитных реакций, в том числе экспрессию многих генов, связанных срепарацией. Физиологические изменения в клетке под действием SOS-системы называют SOSответом [Миронов А.
Н. и др., 2012]. В качестве тестерного штамма в исследованиииспользован штамм Escherichia coli PQ 37 с генотипом F- thr leu his-4 pyrD thi galE galКlacΔU169 srl300::Th10 rpoB rpsL uvrA rfa trp::Mис+ sfi A::Mud(Aр, lac)cts. Благодаряприсутствию «сшивки» генов sfi A::lac Z, экспрессия гена β-галактозидазы lacZ в штамме PQ 37находится под контролем промотора гена sfiA, одного из компонентов SOS-регулона E.coli.Показателем SOS-индуцирующей активности исследуемых соединений в SOS-хромотесте15являетсяактивностьконститутивногоβ-галактозидазы,ферментакотораямикроорганизмов–оцениваетсящелочнойотносительнофосфатазы,чтоактивностипозволяетконтролировать также токсический эффект исследуемых соединений на клетки бактерий.Исследование активности β-галактозидазы и щелочной фосфатазы проводили с помощьюспектрофотометра Shimadzu UV-1800 (Japan).Определение цитотоксичности исследуемых соединений проводили с помощью МТТтеста [O’Hare S., Atterwill C.
K., 1995; Simon P. Langdon, 2004; Миронов А. Н. и др., 2012].Линия опухолевых клеток HeLa (ATCC® CCL-2TM), используемая в работе, получена изколлекции банка глубокозамороженных клеточных культур ГУ «НИИВ им. Д. И. ИвановскогоРАМН» и представляет собой эпителиальные клетки аденокарциномы шейки матки человека.Принцип данного метода базируется на способности митохондриальных дегидрогеназ живойметаболически активной клетки превращать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который выпадает в виде кристалловвнутри клетки. Растворение формазана с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) ипоследующая фотометрия цветного (фиолетового) раствора позволяет косвенно оценить долюпогибших клеток под влиянием изучаемого соединения по изменению оптической плотностираствора в опытных лунках по отношению к контрольным. Оптическая плотность раствораопределялась на микропланшетном ИФА-фотометре (Immunochem 2100 «High Technology Inc.»,США).Для определения генотоксичности исследуемых соединений использовали тест Эймса[Миронов А.
Н. и др., 2012; Маргулис А. Б. и др., 2012]. Принцип теста Эймса базируется накультивировании тест-штаммов Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium TA100:генотип: hisG46, rfa, uvr-, pkm101, bio-, ревертирование к прототрофности происходит путемзамены пар оснований, коллекция микроорганизмов кафедры генетики ФГБОУ ВО «МГУ им.М. В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
