Автореферат (1139663), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Полосы нуклеиновых кислот в гелеидентифицировали в УФ с длиной волны 254 нм и фотографировали спомощью цифровой камеры Kodak Digital Camera на приборе Kodak EDAS290. Фотографии анализировали с помощью программы Adobe Photoshop CS,Version 8.0.Определение порога чувствительности проводилось методом серийныхразведений исходной ДНК. Применялись разведения 1:5, 1:10, 1:50 и 1:100.Предварительно микроскопическим методом подсчитывалось количествопаразитов в пробе.15Статистическая обработка результатовПолученныерезультатыобрабатывалистатистическисиспользованием программных пакетов BioStat Proffessional 5.8.4 и MicrosoftExcel 2010.Статистическуюпогрешностьвычислялисучетомсреднегоквадратичного отклонения качественных признаков (m).Оценку зараженности производили как в процентах, так и припомощи индекса MFIR (Minimum field infection rate), который вычислялся поформуле: (количество зараженных проб/количество комаров) х1000.16РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙРезультаты проведенных исследований позволили сформулировать иобосновать три основных положения диссертации.ПЕРВОЕ ПОЛОЖЕНИЕ.
Формирование научного направления«молекулярная паразитология» открывает новые возможности длямедицинской науки и практики здравоохранения и государственногосанитарно-эпидемиологического надзора. Применение характерных длямолекулярноймедицины,поканедостаточноиспользуемыхвмедицинской паразитологии, молекулярно-биологических технологий,позволяет получить новые научные данные и существенно расширитьнаучные знания в этиологии и патогенезе паразитарных болезней, воткрытии истинных причин возникновения ряда массовых социальнозначимых заболеваний человека, пока относимых к неинфекционнымболезням.Начало ХХI века характеризуется появлением новых для нашейстраны потенциально опасных паразитарных болезней и инвазивныхпереносчиков, способных передавать экзотических для России возбудителейтропических арбовирусных лихорадок с одной стороны и возникновениемлекарственной устойчивости у возбудителей ряда паразитарных болезней клекарственнымпрепаратам.Последнееприводиткзначительномуудорожанию лечения и борьбы с такими болезнями, с другой стороныдиктует настоятельную необходимость создания и широкого использованияновых более чувствительных, эффективных и экономичных методовдиагностики.
Одним из возможных путей решения этой важной социальноэкономической проблемы должны стать разработка и внедрение в практикуздравоохранениянадзораиГосударственногомолекулярно-биологическихсанитарно-эпидемиологическогометодов индикациииэкспресс-идентификации геномов эпидемически опасных паразитарных патогенов илиих фрагментов непосредственно в клиническом материале без длительной17стадии культивирования и получения чистых культур возбудителей.Оптимальным решением для сформулированных задач представляетсяразработка широкого спектра диагностикумов на основе полимеразнойцепной реакции (ПЦР). Различные варианты исполнения ПЦР требуютразных трудозатрат и времени для получения конечного результата,поскольку необходимо использовать разное по набору и стоимостиоборудование.
Это предполагает, что в зависимости от конкретных целей наразных уровнях структуры практического здравоохранения и органовучреждений Государственного санитарно-эпидемиологического надзора,можно будет создавать оптимальные наборы оборудования для наиболееэкономного оснащения соответствующих лабораторий или использованияужесуществующихвсистемепрактическогоздравоохраненияилиРоспотребнадзора ПЦР-лабораторий.Наибольшая потребность в новых методах молекулярной диагностикисуществует в области трансмиссивных паразитозов: малярии, лейшманиозови дирофиляриозов.
Это связано с тем, что ПЦР в этом случае будетиспользована не только как диагностический инструмент, но и какэффективная методология поиска генетических различий между штаммами(малярия), видами и подвидами (лейшманиозы), а также обнаруженияпаразитов в переносчике (дирофиляриозы). В этих случаях ПЦР используетсякак предварительный метод перед применением прямого секвенирования илидругих молекулярно-генетических методов.Применение ПЦР при диагностике малярии и лейшманиозов имеетособую ценность в условиях референс-центров, так как дает возможностьнакопления значительных количеств препаратов, присланных на контроль.При применении ПЦР в референс-центре используется методика выделенияДНК паразита из препаратов крови толстая капля, ранее окрашенных поРомановскому-Гимза, разработанная в НИИМПиТМ им.Е.И.Марциновского.Высокая чувствительность ПЦР дает большие преимущества для выявленияскрытых источников инфекции с субклинической паразитемией, например,18при расследовании случаев прививной малярии у реципиентов крови илисреди наркоманов, а также для поиска источников инфекции в очагах сместной передачей при элиминации малярии.
Кроме того, ПЦР позволяетлегковыявитьсмешаннуюинфекцию,чтовызываетопределенныесложности микроскопическими методами поскольку при микст-инфекцииодин из видов (P.falciparum) обычно превалирует и маскирует единичныхпаразитов другого вида.Сформулированный подход чрезвычайно важен и для некоторыхнозоформ нетрансмиссивных паразитозов, например амебиаза.
Быстрая инадежнаядифференциациякомменсаловE.disparилипатогеннойинвазивнойE.moshkovskyE.histolyticaневозможнанаотосновеморфологических микроскопических исследований. Для осуществлениядифференциальнойпостановкидиагностикидиагнозаподобного,возбудителяикритическиопределенияважноготактикидлялечениянеобходимо использование молекулярно-биологических технологий.Ограничения применения ПЦР при рутинной диагностике паразитозовсвязаны со сложным жизненным циклом паразитов, когда паразит на разныхстадиях жизненного цикла изменяет свою локализацию в организме хозяинаи невозможно определить, какой материал оптимально пригоден дляисследования.
Так, например, применение ПЦР диагностики у больныхгеогельминтозами нецелесообразно, поскольку микроскопия дает достаточнобыстрый видоспецифический результат. Наши исследования показали, чтоприменение ПЦР при геогельминтозах возможно при проведении санитарнопаразитологических исследований для выявления уровня загрязненностисреды обитания человека инвазионными стадиями гельминтов. В этом случаепостановка ПЦР позволяет значительно сократить трудозатраты.Значительное сокращение трудозатрат при постановке ПЦР всравнениисдругимиметодамидостигаетсятолькопримассовыхобследованиях так как время, необходимое для постановки 1 или 50 проб,отличается не более чем на 10%. Еще более значительного сокращения19трудозатрат удается добиться при применении ПЦР в реальном времени,поскольку при применении этого метода отсутствует стадия электрофореза, адлительность ПЦР сокращена до 1 часа.
Таким образом, молекулярнобиологическиеметодыимеютзначительныеперспективывпаразитологии, как в научных исследованиях, так и в практическомздравоохранении.Обобщено указанное новое для медицинской паразитологии научноенаправлениемыобозначилиПодключениеметодологиикак«молекулярнаямолекулярнойбиологиипаразитология».имолекулярноймедицины к изучению паразитарных болезней в перспективе должнопривести к созданию принципиально новых способов диагностики, лечения ипрофилактикиэтойсоциальнозначимойпаразитарнойпатологии.Расшифровка молекулярных механизмов взаимодействия паразита и хозяинапозволит направленно конструировать инструменты управления патогенезомразличных паразитозов и модулировать защитные системы организмахозяина.
Уже сейчас начинают создаваться лекарственные препараты для«таргетной терапии» некоторых гельминтозов. Именно такой подход образносформулировал лауреат Нобелевской премии Дж. Ледерберг, указав, что «вгонке за выживание с микробными генами нашим оружием должен статьчеловеческий разум, а не естественный отбор наших генов».Настоящаяметодологиидиссертациямониторингазасодержитрезультатыразработаннойсоциальнозначимымипаразитарнымиболезнями с использованием ПЦР-технологий в рамках сформулированнойконцепции «молекулярной паразитологии».В области молекулярно-биологической диагностики трансмиссивныхпаразитозов была разработана оригинальная технология ПЦР-диагностикималярии на основе выделения ДНК из препарата крови «толстая капля».Определены оптимальные режимы постановки ПЦР-диагностики малярии.Предложен метод одноэтапной ПЦР с использованием флюоресцентной20детекции в реальном времени.
Доказано, что качество и сроки храненияпрепарата «толстая капля» не влияют на результаты ПЦР-диагностики.Усовершенствована методика постановки ПЦР для диагностикивисцерального лейшманиоза. Экспериментальным путем была установленаоптимальная температура отжига праймеров – 530С и число цикловамплификации (40) обеспечивающих получение наибольшего количестваПЦР продукта.Выбраны и синтезированы праймеры для диагностики DirofilariaиrepensD.immitis.Подобранынаиболееэффективныережимыамплификации для этих праймеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
