Автореферат (1139553), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Данные результаты могут служить обоснованием для расширения общепринятой панели маркеров при фенотипировании лимфоцитов и оценки субпопуляционного состава лимфоцитов крови у онкологических больных.Экспериментальное моделирование блокирования активирующих рецепторовNKG2D на NK-клеткахДля того, чтобы проверить, что циркулирующий MICA может блокировать NKG2D иизучить влияние растворимых форм стресс-индуцированных молекул MICA на активностьNK-клеток мы провели серию экспериментов ex vivo. Для этого был получен, охарактеризован и очищен рекомбинантный белок человека MICA (rhMICA).В качестве источника sMICA использован rhMICA в концентрациях 0, 1, 5 и 10мкг/мл. Измеряли долю NK-клеток и уровень экспрессии NKG2D на их поверхности.
Было20установлено, что кратковременная инкубация свежевыделенных лимфоцитов с rhMICA приводит к резкому снижению уровня поверхностной экспрессии NKG2D на NK-клетках(рис.3).101012,89%31021101034,21%101041,29%010110210CD56-FITC3104107,23%101030,23%31021101048,21%11,61%04CD314-PECD314-PE104CD314-PE100110210CD56-FITC3103,41%4,38%32184,55%14,32%0104410107,65%0010110210CD56-FITC310410АБВРисунок 3 - Снижение уровня поверхностной экспрессии NKG2D на CD3-CD56+ лимфоцитах здорового донора после инкубации лимфоцитов в присутствии высоких концентраций rhMICA (типичный пример).
Без обработки rhMICA (А), обработка мононуклеаров rhMICA в концентрации 1 мкг/мл (Б) и 5 мкг/мл (В)Однако, после активации МНК в присутствии IL-2 и IL-15 цитотоксические лимфоциты обладали повышенной экспрессией NKG2D, которая не ингибировалась в полной мере,несмотря на присутствие rhMICA. Также показано, что активированные лимфоциты, дажепосле инкубации с лигандом NKG2D, обладают более высокой цитотоксической активностью по сравнению с нативными NK-клетками. Полученные данные могут свидетельствоватьв пользу проведения АИТ с помощью активированных цитотоксических лимфоцитов. Экспериментальные данные указывают на наличие опосредованных NKG2D механизмов в регуляции функций естественных киллеров при взаимодействии с опухолевыми клетками, экспрессирующими лиганды NKG2D, и растворимыми формами этих молекул.II – Разработка метода длительного культивирования и активациилимфоцитов для адоптивной иммунотерапииВ данном исследовании для активации МНК первоначально использовали IL-2 в различных концентрациях от 31,25; 62,5; 125; 250 до 500 МЕ/мл и культивировали их на протяжении 10-14 дней.
Было показано, что лимфоциты пролиферируют пропорционально увеличению концентрации цитокина. Наибольшая пролиферативная активность наблюдалась примаксимальной концентрации IL-2 в 500 МЕ/мл, однако в данном случае была достоверноснижена жизнеспособность лимфоцитов (р<0,05), что не позволяло длительно культивировать лимфоциты. Отмечено, что в присутствии IL-2 в более низких концентрациях пролиферация лимфоцитов в первые трое суток культивирования в среднем увеличивалась на75±15%. При активации в присутствии IL-2 в концентрации 250 МЕ/мл количество клеток21увеличивается в два раза через 5-6 дней культивирования. Поэтому мы выбрали данную концентрацию IL-2. Замечено, что в данных условиях культивирования со второго дня лимфоциты начинают изменять форму с круглой на продолговатую и неровную и увеличиваться вразмерах (рис.4А).
Некоторые CD45+CD14neg лимфоциты прилипали к пластику (рис.4Б).АБРисунок 4 - Влияние IL-2 на морфологию лимфоцитов (ув. х400)А) морфология мононуклеаров через 3 дня культивирования в среде с IL-2;Б) через 5 дней культивирования в среде с IL-2Показано, что при добавлении в среду второго цитокина – IL-15, пролиферация лимфоцитов достоверно выше, чем в среде с одним IL-2 (рис.5). При дальнейшем культивировании к 14 дню количество клеток увеличивалось в несколько раз, чего не было достигнуто всреде c IL-2.На фоне увеличения пролиферации повышалась цитокинопродукция и значимо возросла экспрессия маркеров активации лимфоцитов. У больных с ОЖКТ экспрессия альфацепи рецептора IL-2 (СD25) увеличилась в 1,7 раз, HLA-DR – в 1,5 раз, СD314 – в 1,5 раза, аСD38 – в 1,7 раз, CD69 на лимфоцитах в 2,9 раз, а на NK-клетках – в 2,2 раза (р<0,05). Убольных меланомой изменения в активации были более выражены.
Экспрессия CD25 налимфоцитах значимо увеличилась в 2,2 раза, HLA-DR – в 3,2 раза, СD314 – в 1,6 раз, СD38 –в 1,4 раза, CD69 на лимфоцитах в 4,3 раза, а CD69 на NK-клетках в 3,6 раз (p<0,05). Количество незрелых CD45+RA+-клеток уменьшилось пропорционально увеличению доли зрелыхCD45+RO+ клеток в культуре [Абакушина Е.В. и др. 2016, Кудрявцев И.В. и др. 2015].22Рисунок 5 - Влияние IL-2 и IL-15 на конфлюентность лимфоцитов больногоПри культивировании клеток в среде с IL-2 и IL-15 значимо увеличилось количество NKклеток на 49,4% и активированных лимфоцитов, среди которых в большей степени возрослаэкспрессия HLA-DR на 183,3%, CD69 на 97,1%, CD25 на 58% и в меньшей степени увеличиласьэкспрессия CD38 на 37,9% и NKG2D на 28,9% (p<0,05) (рис.6).Доля CTL незначительно увеличилась в среднем с 37,4±8,9% до 41,2±11% по сравнениюс культивированием в среде только с IL-2.
Количество NKT-клеток в большей степени начиналоувеличиваться уже после 3 дня культивирования с двумя интерлейкинами и к 6 дню их доля составляла в среднем 14%. Таким образом, количество цитотоксических лимфоцитов в популяцииактивированных МНК составило более 80%.23B-кл.CD69+NK-кл*CD69+Т-кл. *CD69 ****CD38+Т-кл.
*Т-кл.ТhCD4+CD25+*****CD38400350300250200150*100500******CD25 (IL2ɑ)HLA-DR**CTL**NK-кл.NKG2DNKG2D+NKHLA-DR+Т-кл.без ILс IL-2с IL-2 и IL-15Рисунок 6 - Изменение поверхностной экспрессии маркеров активации на культивируемых лимфоцитах сразу после выделения (100%) и через 3 дня в среде с IL-2 и присовместном культивировании с IL-2 и IL-15;*значимое отличие количества клеток до и после активации МНК (p<0,05)Было доказано, что параллельно с увеличением поверхностной экспрессии маркеров активации повышается цитотоксическая активность эффекторных лимфоцитов.
Показано, что активность ЦИК-клеток в 1,6 раз выше, чем не активированных лимфоцитов и достоверно выше,чем у ЛАК-клеток (p<0,05) (рис.7).Через 24 часа после начала культивирования наблюдается стремительный рост цитотоксической активности ЦИК-клеток, который достигает максимальных значений через 42 часа, чтопочти на сутки раньше, чем при активации одним IL-2. Данная противоопухолевая активностьлимфоцитов по отношению к клеткам-мишеням линии К562 сохраняется и в последующие дникультивирования.В результате данного раздела исследования разработан метод длительного культивирования и активации лимфоцитов, выделенных из периферической крови человека.
Установлено,что культура активированных лимфоцитов характеризуется присутствием 70-80% эффекторныхклеток (CTL, NK, NKT) и повышенной пролиферативной и цитотоксической активностью, атакже отличается высоким уровнем экспрессии активирующих рецепторов CD38, CD25, CD69,NKG2D и HLA-DR.24Рисунок 7 - Увеличение количества мертвых клеток-мишеней (красная флуоресценция Ethd-1) после инкубации с лимфоцитами больного меланомой без активации(0 день) и через 3 дня культивирования в средах с IL-2 и в комбинации IL-2/IL-15(соотношение мишень:эффектор 1:20)Таким образом, в настоящей работе представлена комплексная морфофункциональная ииммунофенотипическая характеристика активированных цитотоксических лимфоцитов, которые использовались для АИТ злокачественных новообразований.III – Результаты клинической апробации метода адоптивной иммунотерапииЦелью данного этапа исследования была оценка безопасности и переносимости АИТ сиспользованием активированных цитотоксических лимфоцитов (АЦЛ), полученных на предыдущем этапе работы.
Каждому из 79 больных, включенных в исследование, было проведено отодного до двенадцати курсов АИТ, длительностью от 20 дней до 3 месяцев в зависимости от количества полученных лимфоцитов и индивидуальной схемы лечения.Иммунотерапия АЦЛ была первоначально апробирована у 15 больных с разными онкологическими заболеваниями (таблица 2).Всем больным было суммарно проведено 40 курсов АИТ, в среднем по 2,7 курса. Введение биологического продукта проводили паравертебрально внутрикожно в несколько точек (рис. 8).Проведенная оценка клинической эффективности АИТ у этой группы больных ракомпозволила диагностировать ЧО у двух (13,3%) пациентов.
Стабилизация процесса была отмечена у 6 больных (40%), у 4 из которых АИТ проводилась в самостоятельном режиме. Прогрессирование заболевания было у 5 больных (33,3%).Ни у одного из 15 пациента не было замечено ухудшения самочувствия, нежелательных явлений и выраженных побочных реакций (изъязвлений в месте инъекции, аллергиче25ских реакций, желудочно-кишечных расстройств), связанных с введением клеток или биопродукта.
В 4 (26,7%) случаях у больных наблюдалась местная гиперреакция, которая появлялась через 24-72 часа после повторного введения активированных клеток, проявляласьучастками гиперемии в местах введения и зудом и сохранялась от нескольких дней до нескольких недель. У трети больных (5/15; 33,3%) наблюдалась немедленная местная реакции,которая проявлялась гиперемией кожи вокруг мест введения биопродукта (рис. 9).Рисунок 8 - Введение активированных цитотоксических лимфоцитов внутрикожно паравертебрально в несколько точек.Рисунок 9 - Местная реакция гиперемии на введениеактивированных цитотоксических лимфоцитовПосле проведения апробации метода АИТ мы продолжили исследование и объединили13 пациентов с КРР в одну группу, вторую группу составил 51 больной меланомой кожи.Большинство больных КРР – 12 (92,3%) исчерпали возможности стандартного лечения.Они получали различные виды противоопухолевого лечения. Комбинированное лечение проведено у 11 (15%) больных, комплексное у 1 (15%) больного.
Среди 51 больного меланомойкомплексное или комбинированное лечение получили 46 больных (90,2%). Оно включалооперативное вмешательство у 45 человек, пред- и/или после операционную ЛТ у 44 больных,одну линию ХТ дакарбазином или две с мюстофораном у 42 больных, ИТ была проведена у 3(5,9%) и ФДТ у 3 (5,9%) пациентов. Единственный метод лечения предшествовал АИТ у 5(9,8%) больных.Всем больным КРР суммарно было проведено 26 курсов АИТ, а больным меланомойсуммарно проведено 164 курса АИТ, в среднем по 2-3 курса в интервале от 1 до 12 курсов АИТ.Ни у одного больного не было замечено нежелательных явлений и побочных реакций, кроменезначительного зуда в месте введения биопродукта. Аллергические реакции и какие-либо иныевиды непереносимости АИТ не были зарегистрированы. У онкологических больных АИТ, вызывала, главным образом, гриппоподобный синдром, основным проявлением которого были26умеренная гипертермия в 35,3% случаев, которая не требовала медикаментозной коррекции ибыла связана с терапевтическим действием АИТ.
Изменения показателей периферической крови, функции почек и печени при данном виде лечения не отмечалось.У всех 64 больных были оценены результаты проведения АИТ по критериям irRC (таблица 8, 9) и статус физического состояния по шкале ECOG.Полного объективного ответа на лечение получено не было. Однако ЧО зафиксирован у6 из 51 больного меланомой, чего не наблюдалось у больных КРР.
СБ была достигнута почти вполовине наблюдений у больных меланомой (52,9%) и КРР (46,2%) (таблица 8). У остальныхбольных наблюдалось прогрессирование заболевания.Среди больных с достигнутым ответом на лечение медиана времени до достиженияклинического ответа составила в среднем 3,3 месяца в интервале от 1 до 7 месяцев, а продолжительность безрецидивного периода на момент анализа, составила 27 месяцев (от 7 до48 месяцев).Таблица 8Эффективность комплексного лечения с включением АИТ активированнымилимфоцитами у больных КРР и меланомойСтабилизация болезниЧастичная регрессияКонтроль над ростом опухолиПрогрессирование болезниМедиана ВДП от начала АИТ,интервал (мес.)КРР, n=13 (%)6 (46,2)0 (0)6 (46,2)7 (53,8)Меланома, n=51 (%)21 (41,2)6 (11,8)27 (52,9)24 (47,1)13,5 (3-37)27 (7-48)Гиперемия, подобная замедленной провоспалительной реакции, отмечалась в местевведения биопродукта у 14 (27,5%) больных меланомой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
