Диссертация (1139532), страница 15
Текст из файла (страница 15)
В.Н. Ореховича РАМН (г.Москва).2.3. Материалы и методы экспериментального исследования накрысахЭкспериментальную часть исследования проводили на базе кафедрыбиологической химии Харьковского национального медицинского университетав рамках «Договора о взаимном сотрудничестве в области медицинскогообразования и науки между ФГАОУ ВПО «Белгородский государственныйнациональныйисследовательскийуниверситет»(Белгород,РоссийскаяФедерация) и Харьковским национальным медицинским университетом(Харьков, Украина) от 11.10.2012г.».Объектом исследования явились 120 крыс-самцов линии Вистарвозрастом 10 и 24 месяца, которых содержали в стандартных условиях вивария.Использовали следующие группы животных: 1) интактные крысы 10 месяцев(n=10); 2) интактные крысы 24 месяцев (n=10); 3) крысы с экспериментальнойишемией миокарда 10 месяцев (n=10); 4) крысы с экспериментальной ишемиеймиокарда 24 месяцев (n=10); 5) крысы с ишемией миокарда 10 месяцев,которым вводили триметазидин (n=10); 6) крысы с ишемией миокарда 2487месяцев, которым вводили триметазидин (n=10); 7) крысы с ишемией миокарда10 месяцев, которым вводили милдронат (n=10); 8) крысы с ишемией миокарда24 месяцев, которым вводили милдронат (n=10); 9) крысы с ишемией миокарда10 месяцев, которым вводили цитофлавин (n=10); 10) крысы с ишемиеймиокарда 24 месяцев, которым вводили цитофлавин (n=10); 11) крысы сишемией миокарда 10 месяцев, которым вводили фосфокреатин (n=10); 12)крысы с ишемией миокарда 24 месяцев, которым вводили фосфокреатин (n=10).Возраст животных выбирали с позиции соответствия 10-месячных крыс –среднему возрасту человека, 24-месячных крыс – пожилому возрасту человека.Содержание животных и манипуляции с ними проводили в соответствии сположениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных,которые используются для экспериментальных целей (Страсбург, 1986).Моделирование ИБС проводили по методу, описанному Гаман Д.В.
(2011)[30]: ежедневно в течение 7 дней подкожно крысам вводили 0,1 мл 0,1%раствора адреналина. Дозу вводимых с терапевтической целью лекарственныхпрепаратов рассчитывали по формуле Рыболовлева Ю.Р. [174], она составила 1)для триметазидина (чистого сухого вещества фирмы «Sigma Aldrich») 0,5мг/100грамм крысы в 2 мл 0,9% раствора NaCl внутрижелудочно 2 раза всутки, что эквивалентно рекомендуемой дозе триметазидина для человека (35мг 2 раза в сутки перорально); 2) для мельдония (милдроната фирмы «Grindex»,Латвия) - 0,03мл/100грамм крысы в 1,5 мл 0,9% раствора NaCl внутривенно 1раз в сутки, что эквивалентно рекомендованной дозе для человека (5 млвнутривенно 1 раз в сутки); 3) для цитофлавина - 0,07мл/100грамм крысы в 1,5мл 0,9% раствора NaCl внутривенно 1 раз в сутки, что эквивалентнорекомендованной дозе для человека (10 мл внутривенно капельно в разведении200 мл 0,9% раствора NaCl 1 раз в сутки); 4) для фосфокреатина-13мг/100грамм крысы в 2 мл 0,9% раствора NaCl внутривенно 1 раз в сутки, что88эквивалентно дозе препарата «Неотон» у человека (2г/сутки внутривеннокапельно).Животных выводили из эксперимента через 10 дней послевведенияпрепаратов путем декапитации.
Сердце перфузировали охлажденным 0,9%растворомNaCl.Приготовлениегомогенатовмиокардаивыделениемитохондрий производили по методу, описанному Н.П. Мешковой, С.Е.Севериным [159]. Из гепаринизированной крови выделяли эритроцитыцентрифугированием. Отмытые эритроциты использовали для определениясодержания 2,3-ДФГ и свободных нуклеотидов (АТФ и АДФ) [25,129]. Всыворотке крови определяли содержание АТФ, АДФ, пирувата, лактата, МВфракции креатинфосфокиназы (КФК-МВ) сфирмыHBP“DAC-SpectroMed”помощью наборов реагентов(Кишинёв,Молдова),активностьлактатдегидрогеназы1 (ЛДГ1) – с помощью наборов реагентов фирмы Labsystem(Финляндия) спектрофотометрическими методами [123]; в митохондрияхисследовали активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), цитратсинтазы (ЦС) ипируватдегидрогеназы (ПДГ) [123]; в гомогенате миокарда определялиактивность гексокиназы, креатинфосфокиназы (КФК), фосфофруктокиназы(ФФК), уровень пирувата, лактата и АТФ спектрофотометрическими методами[123,159].2.4.
Материалы и методы исследования препаратовметаболического ряда в тестах in vitroНами были разработаны и оформлены в виде изобретения две методикиперсонализированноговыбораметаболическогокорректораконкретномубольному на основании определения индивидуальной реактивности генома и89митохондрий человека на лекарственные препараты в тестах in vitro.
Для этихцелей использовали методы ДНК-комет и конфокальной микроскопии.В России существует система оценки мутагенности лекарств [122]. Дляоценки мутагенности лекарств широко используется метод ДНК-комет какбыстрый и чувствительный метод оценки повреждений и репарации ДНК вотдельных клетках [264].Метод ДНК-комет применяется для тестированияразличных факторов среды на мутагенную активность, объективность данногометодакакпоказателямутационногопроцессаилигенетическойнестабильности на сегодняшний день не вызывает сомнений [20,193].
Однако,данная система предусматривает оценку генотоксичности или мутагенностиновых фармакологических субстанций только у животных и только надоклиническом этапе исследований.Мы поставили перед собой задачу определения индивидуальнойэффективности и безопасности уже зарегистрированных лекарственных средствиз группы метаболических корректоров перед использованием у пациентов,имеющих медицинские показания к их назначению.
Для решения этой задачинамибылпредложен«Способпрогнозированияиндивидуальнойэффективности и безопасности препаратов метаболического ряда по влияниюна геном человека в пробах in vitro». Данный способ позволяет на основанииизучения реакции генома человека на введение метаболически активныхлекарственных средствв пробах in vitro определять их потенциальнуюгенотоксичность либо генопротекторный эффект.Техническое решение нашего изобретения заключается в следующем:проводят генетическое исследование лейкоцитов крови и определяют степеньразрушения ДНК методом ДНК-комет по показателям индекса ДНК-комет и%ДНК в хвосте кометы, как в исходном статусе, так и при добавлении кобразцу крови in vitro исследуемого препарата в дозе, эквивалентной разовой90дозе, рекомендуемой пациенту, с последующим расчётом показателей приростаиндекса ДНК-комет и %ДНК в хвосте кометы по формулам:ΔInd ДНК комет Δ% ДНК в хвосте Ind ДНК комет метаболический препарат Ind ДНК комет исходнInd ДНК комет исходн% ДНК в хвосте метаболический препарат % ДНК в хвосте исходн% ДНК в хвосте исходн,(1),(2)где ΔInd ДНК комет – прирост индекса ДНК комет, Ind ДНК комет исходн – индекс ДНК кометв исходном статусе, Ind ДНК комет метаболический препарат – индекс ДНК комет при добавлениик образцу крови лекарственного препарата метаболического ряда; Δ% ДНК в хвосте –прирост процента ДНК в хвосте кометы, % ДНК в хвосте исходн – процент ДНК в хвостекометы в исходном статусе, % ДНК в хвосте метаболический препарат – процент ДНК в хвостекометыпридобавлениикобразцукровиисследуемогопрепаратаметаболического ряда.При значении показателей прироста (∆IndДНКделаютзаключениеобиндивидуальнойкомети ∆%ДНКгенотоксичностив хвосте)>0препаратаипрогнозируют нецелесообразность его назначения конкретному пациенту; призначении данных показателей <0 делают заключение о позитивном влияниипрепарата метаболического ряда на геном с восстановлением структурыпоследнего и прогнозируют эффективность и безопасность использованияданного лекарственного препарата у конкретного пациента.Тестирование лекарственных препаратов методом ДНК-комет быловыполнено в лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии91Белгородскогогосударственногонациональногоисследовательскогоуниверситета.
Схема эксперимента приведена в таблице 2.2.таблица 2.2.Исследование генотоксических свойств лекарственных препаратов метаболического рядаНаименованиеИсследуемаяКоличествоКонцентрацияКоличестволекарственногоразовая дозатестируемыхлекарственногофиз.препараталекарственноголейкоцитов впрепарата,раствора,препарата,пробевносимого ввносимого ввносимаяпробупробупациентуФосфокреатин2г80 мкл7,1 мкл280 мкл(неотон)Триметазидин35мг80 мкл2,5 мкл280 мклМельдоний500мг80 мкл3,6 мкл280 мкл(милдронат)Цитофлавин10мл80 мкл0,32 мкл280 мклТестирование препаратов метаболического ряда методом ДНК-кометпроводили у 90 больных: фосфокреатин исследовали у 33 пациентов,триметазидин – у 39 человек, мельдоний – у 35 больных и цитофлавин – у 30пациентов (у ряда пациентов удавалось тестировать сразу несколькопрепаратов).Разработанный нами «Способ определения индивидуальной реактивностимитохондрий человека под действием препаратов метаболического ряда впробах in vitro» основан на визуализации флюоресценции митохондрий,который выполняли с помощью лазерной сканирующей конфокальноймикроскопии [260].
Метод позволяет визуализировать объект вобъеме,наблюдать процессы непосредственно внутри клетки. Высокая скоростьсканирования обеспечивает получение данных в динамике по времени, чтоважно для регистрации физиологических процессов в клетках.В ходе нашего исследования использовали конфокальный лазерныйсканирующий микроскоп Nikon Eclipse Ti. Сканирование осуществляли при92длиневолны460нм.Длявизуализацииизображенияиспользовалиспециализированную программу Nikon С1.Лейкоциты отбирали из цельной крови, после центрифугирования. Длякаждой пробы были подготовлены 5 препаратов: контроль с пиреном (клетки,которые не подвергали инкубации) и опытные препараты – лейкоциты, ккоторым добавляли тестируемые лекарственные вещества (триметазидин,мельдоний, цитофлавин, фосфокреатин), окрашенные пиреном.Пирен – химическое соединение с формулой C16H10, полициклическийароматический углеводород. Белое кристаллическое вещество.
Растворим вэтаноле, диэтиловом эфире, бензоле, не растворим в воде. В растворенномсостоянии флюоресцирует голубым цветом. Исследования установили, чтопирен способен связываться с фосфолипидами мембран [271]. При этом вспектре флюоресценции пирена, встроенного в мембрану, обнаруживаются 3пика (в области 370-390 нм), характерные для мономерной формы пирена, иодин пик (в области 460-470 нм), характерный для эксимера пирена – димера,состоящего из одной возбужденной и одной невозбужденной молекулы зонда.Поэтому этот флюоресцентный зонд может быть использован для определенияструктурно-функционального состояния мембран энергетической системыклетки, в частности их текучесть и погруженность [271].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
