Автореферат (1139515), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Как видно из таблицы в группе здоровых новорожденных выявленаположительная ассоциация экспрессии TLR2 и HBD-1, TLR2 и HBD-2, HBD-1 и HBD-2 (приэтом коэффициент составил 0,734, 0,734, 0,781, соответственно). В группе новорожденных сВУП была определена аналогичная зависимость. А в группе с РНП корреляция показателейбыла иной - HBD-1 и HBD-2 (коэффициент 0,918). Также была найдена слабая обратнаязависимость между TLR4 и HBD-2. На следующем этапе работы мы провели исследованиеизменения экспрессионных профилей молекул врожденного иммунитета относительноэтиологического фактора.
Показано, что экспрессия гена TLR2 снижалась в 6,2 раза у25пациентов с K.pneumonia и в два раза и более при смешанной инфекции. Уровни экспрессиигена TLR4 были снижены более чем в три раза при инфекции, вызванной E.coli (рис.4 a, б).Таблица 2Показатели экспрессии генов врожденного иммунитета в эпителиальных клеткахверхних дыхательных путей у новорожденных с ВУП и РНПИсследуемая группаЭкспрессиягена TLR2Экспрессиягена TLR4Экспрессиягена HBD-1Экспрессиягена HBD-2Экспрессиягена TNFαЭкспрессиягена NF-kBГруппасравнения 1(здоровыеноворожденные) х103******************Примечание - «#» –ГруппаГруппаГруппасравнения 2новорожденных новорожденн(здоровыес ВУПых с РНПноворожденх103х103ные с инф.)х103149,66110,09698,502379,86 #(64,9 - 428,8) (225,3 - 2872,5)(72,14 - 140,0)(57,02 160,25)1-1,359-1,5192,538#0,7960,6040,4530,354 #(0,54-1,08)(0,48-0,69)(0,28-0,60)(0,31-0,37)1-1,3180-1,757-2,248#7,6027,447,14814,975 #(6,47-12,59)(7,07-15,95)(5,25-9,29)(10,86-17,08)1-1,021-1,0631,970#39,74641,12641,469182,17 #(22,85-87,41)(22,39-67,14)(22,30-69,62)(101,91-32,98)11,0351,0434,583#2,195,0513,32#10,04#(1,78-5,88)(3,56-11,76)(3,04-23,12)(7,07 -16,95)12,36,069#4,577#5,1710,8621,84#13,42#(3,35-11,76)(6,71-23,52)(6,94-38,09)(15,24-38,94)12,14,222#2,594#показатель достоверно отличается от такового в группе сравнения 1(p 0,05).
Для расчета использовали критерий Манна-Уитни.* - Количество копий относит экспрессии гена актина, ** - Отношение показателя в норме кпоказателю при патологии.Далее были определены уровни экспрессии генов HBD-1 и HBD-2 в эпителиальныхклетках верхних дыхательных путей в группах новорожденных с ВУП, с РНП и у здоровыхдетей.
Показано, что экспрессия гена HBD-2 увеличивается в 2,3 раза у новорожденных, укоторых определяется инфекционный возбудитель, но при этом отсутствуют клиническиепроявления пневмонии. Также показано достоверное снижение показателя HBD-2 (в 3,2 раза)у пациентов с пневмонией, вызванной K. pneumonia (рис.4 в, г).Помимо дефенсинов, был проведен анализ экспрессии генов провоспалительногоцитокина TNFα и фактора транскрипции NF-kB в эпителиальных клетках верхних26дыхательных путей в исследуемых группах. Данные молекулы участвуют в сигнальном путис TLRs. Так, было показано, что у детей, у которых выявляли инфекционные возбудители, ноне было клинических проявлений, показатель цитокина возрастал более чем в два раза.Таблица 3Изучение корреляционной зависимости между уровнем экспрессии исследуемыхпоказателей врожденного иммунитета в эпителиальных клетках слизистой верхнихдыхательных путей у здоровых новорожденных и детей с ВУП и РНП(коэффициент корреляции по Спирмену)TLR2TLR2TLR4HBD-1HBD-2TNFαNF-kBrs = 0.101rs = 0.734rs = 0.781rs = 0.543rs = 0.54TLR2TLR2TLR4HBD-1HBD-2TNFαNF-kBrs = -0.1rs = 0.833rs = 0.983rs = -0.429rs = -0.238TLR2TLR2TLR4HBD-1HBD-2TNFαNF-kBrs = -0.251rs = 0.368rs = 0.918rs = 0.051rs = 0.142Здоровые новорожденныеTLR4HBD-1HBD-2rs = 0.101rs = 0.734 rs = 0.781rs = 0.388 rs = 0.248rs = 0.388rs = 0.734rs = 0.248rs = 0.734rs = 0.543rs = -0.371 rs = 0.543rs = 0.541rs = -0.37rs = 0.54Новорожденные с ВУПTLR4HBD-1HBD-2rs = -0.1rs = 0.833 rs = 0.983rs = -0.117rs = -0.2rs = -0.117rs = 0.85rs = -0.2rs = 0.85rs = 0.452rs = -0.143 rs =-0.381rs = 0.667rs = 0.rs = -0.286Новорожденные с РНПTLR4HBD-1HBD-2rs =- 0.251rs = 0.368 rs = 0.918rs = 0.274 rs = -0.323rs = 0.274rs = 0.308rs =-0.323rs = 0.308rs = 0.188rs = -0.072 rs = -0.024rs = -0.032rs = -0.115 rs = 0.136TNFαrs = 0.543rs = 0.543rs = -0.371rs = 0.543NF-kBrs = 0.54rs = 0.541rs = -0.37rs = 0.54rs = 0,96rs = 0,96TNFαrs = -0.429rs = 0.452rs = -0.143rs = -0.381NF-kBrs = -0.238rs = 0.667rs = 0.rs = -0.286rs = 0.833rs = 0.833TNFαrs = 0.051rs = 0.188rs = -0.072rs = -0.024NF-kBrs = 0.142rs = -0.032rs = -0.115rs = 0.136rs = 0.863rs = 0.863В группах с внутриутробным инфицированием, с пневмонией новорожденных,вызванной E.
coli, P.aeruginosa, кокками и при смешанной инфекции показатель TNFαвозрастал в 3-4 раза относительно показателя в группе сравнения. Уровень экспрессии генаNF-kB достоверно увеличивался только в группах пациентов с внутриутробныминфицированием плода (в 2,5 раза) и у новорожденных с пневмонией, вызванной кокковоймикрофлорой (в 3,1 раз).TLR24TLR4*20-2-4-6а-8*б1.510.50-0.5-1-1.5-2-2.5-3-3.5-4HBD-2HBD-1231.52110.5*00-1-0.5-2-1-3-1.5в-2г-4*Рисунок 4. Экспрессия генов TLR2 (a), TLR4 (б), HBD-1 (в) и HBD-2 (г) в эпителиальных клетках верхних дыхательных путейноворожденных с ВУП и РНППримечание - По оси абсцисс – исследуемые группы. По оси ординат – относительные единицы показателя экспрессии (показатель вопытной группе относительно показателя в группе сравнения).
«*» – показатель достоверно отличается от такового в группе сравнения 1(здоровые новорожденные без инфекции) (p 0,05). Для расчета использовали критерий Манна-Уитни.На основании вышеизложенного можно сделать заключение, что иммунологическиепоказатели (распознающие структуры – TLR2, TLR4, дефенсины HBD-1, HBD-2,провоспалительный цитокин TNFα и фактор транскрипции NF-kB) у новорожденных свнутриутробным инфицированием и с пневмонией изменяются неоднозначно. Выявленатенденция к снижению экспрессии генов TLR2, TLR4 и увеличению экспрессии генов TNFαи NF-kB. Данные изменения коррелируют с инфекционным возбудителем, следовательно,можно предположить, что непосредственно возбудитель за счет действия факторовпатогенности влияет на показатели врожденного иммунитета.Исследование ассоциации полиморфных маркеров в генах TLRs, DEFB1 и цитокинов уноворожденных с неонатальными пневмониямиВ последнее время доказана роль наследственных факторов в интенсивностиреализации механизмов врожденного иммунитета.
Генетическая предрасположенность кразвитию ВУП и РНП связана с наследованием определенных аллелей и генотипов. В даннойработе мы выбрали ряд факторов врожденного иммунитета, которые по даннымбиоинформационного анализа и по результатам экспрессионного профиля имеют большоезначение в защите организма при ВУП/РНП. Все они являются компонентами TLRопосредованного пути.
При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфногомаркера Arg753Gln гена TLR2 среди родильниц, у которых родились дети с ВУП и РНП, атакже в группе родильниц с физиологически протекавшей беременностью и без патологииплода обнаружено преобладание частоты аллеля Arg над частотой аллеля Gln ивстречаемости генотипа ArgArg над встречаемостью генотипов ArgGln и GlnGln во всехисследуемых группах (у родильниц). Отличия распределения аллелей и генотипов междугруппами были недостоверны.Внашейработетакжеисследовалосьраспределениеаллелейигенотиповполиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 у новорожденных с ВУП и РНП.
Полученныеданные, не сильно отличались от данных родильниц. Частота аллеля Arg была значительновыше аллеля Gln и варьировала в диапазоне 0,86 - 0,95 (частота аллеля Gln варьировала вдиапазоне 0,05 - 0,14). Следует отметить, что частота гетерозиготного генотипа была выше,чем в аналогичной группе родильниц. А генотип GlnGln отсутствовал в исследуемых намигруппах новорожденных (табл.4).Таким образом, можно заключить, что полиморфный маркер Arg753Gln гена TLR2 несвязан с ВУИ плода, а также с пневмонией новорожденных.
Другой, исследуемый намигенетический маркер, локализовался в кодирующей области гена TLR4 и реализовался череззамену аминокислоты Asp на Gly в 299 положении. Нами показано, что и у родильниц, и уноворожденных доминировал аллель Asp и генотип AspAsp как в группе сравнения, так и в29опытных группах. Было выявлено, что у родильниц аллель Gly и генотип GlyGlyассоциированы с развитием ВУИ плода. Частота аллеля Gly при этом составляет 0,11, агенотипа - 0.09, в группе сравнения частота аллеля - 0,02, а генотип не определяется. Уноворожденных аллель (частота 0,08) ассоциирована с ВУИ, а также генотип AspGly (частота0,17).
При этом в группе сравнения данный маркер не определялся.Можно сделатьзаключение, что представленные маркеры могут быть использованы сугубо на региональномуровне. Далее нами был проведен поиск других полиморфных маркеров в генах сигнальныхрецепторов врожденного иммунитета, которые могут быть ассоциированы с риском развитияпреждевременных родов или с реализацией внутриутробной инфекции.Таблица 4Распределение аллелей и генотипов маркеров Arg753Gln гена TLR2 и Asp299 Gly генаTLR4 родильниц и новорожденных в группах с ВУП, с РНП и в группе сравненияРодильницыгруппа сравнения 1ВУПРНПArg0,940,940,91Arg753Gln гена TLR2GlnрArg Arg0,060,880,060,90≥0,050,090,88≥0,05новорожденныегруппа сравнения 1ВУПРНПArg0,860,890,95Gln0,140,110,05Asp0,980,890,97Родильницыгруппа сравнения 1ВУПРНПArg Gln0,120,080,06Gln Gln00,020,06р≥0,05≥0,05Arg Arg0,710,780,90Arg Gln0,290,220,10Gln Gln000р≥0,05≥0,05Asp299Gly TLR4GlyрAspAsp0,020,960,11*0,86<0,050,030,96≥0,05AspGly0,040,050,04GlyGly00,09*0р<0,05≥0,05р≥0,05≥0,05новорожденныеAspGlyрAspAspAspGlyGlyGlyргруппа сравнения 1101000,920,08*0,830,17*0ВУП<0,05<0,0510100РНП≥0,05≥0,05Примечание - «*» – показатель достоверно отличается от такового в группе сравнения 1(здоровые новорожденные без инфекции) (p 0,05).
Для расчета использовали критерий χ2, атакже критерий Фишера.Другой маркер, который был оценен в данной работе - G(-20)A, локализованный в генеDEFB1. Однонуклеотидная замена может изменить эффективность транскрипции итрансляции, так же как изменить аминокислотную последовательность и последующуюструктуру белка, и его функцию. В данном исследовании был выбран полиморфный маркер30G(-20)A, расположенный в нетранслируемой области. Предположительно этот SNPs можетвлиять на уровень экспрессии гена дефенсина.
Jurevic R J, et al. (2002) предположил, чтоизменения в экспрессии противомикробных пептидов (в частности дефенсинов) могут бытьсвязаны с различной восприимчивостью к инфекционным агентам и, как следствие,нарушением процессов врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек. Известно,что HBD-1 в основном экспрессируется конститутивно, и, значит, полиморфизмы могутпотенциально влиять на фоновый уровень экспрессии. Ассоциация полиморфного маркераG(-20)A вгене DEFB1 с инфекционной патологией новорожденных (в частности спневмонией) до настоящего времени не исследовалась (рис.5 a, б).0.910.90.80.70.60.50.40.30.20.100.80.70.60.5GG0.4*0.3AAAG*0.20.10aНормаВУПРНПбНормаВУПРНПРисунок 5.
Распределение генотипов маркера G(-20)A гена DEFB1 у родильниц (a) иноворожденных (б) в группах с ВУП, с РНП и в группе сравненияПримечание - По оси абсцисс – исследуемые группы. По оси ординат – частотавстречаемости генотипа, «*» –показатель достоверно отличается от такового в группесравнения 1 (норма), (p 0,05). Для расчета использовали критерий χ2, а также критерийФишера.Анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-20)A у родильниц висследуемых группах выявил некоторые достоверные различия. Так, частоты аллелейданного маркера в группе с внутриутробным инфицированием плода и в группе сравнениябыли следующими: аллель G - 0,66, 0,79, аллель А - 0,34, 0,21, соответственно. Частотааллелей у родильниц, у которых родились новорожденные с ВУП, достоверно не отличалисьот таковых в группе сравнения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
