М.И. Афанасов и др. - Основы радиохимии и радиоэкологии (Практикум) (2008) (1133848), страница 15
Текст из файла (страница 15)
При первом включении прибора проверяют интенсивность темнового тока ФЭУ и при необходимости с помощи регулировки (7)уменьшают её или полностью избавляются от ложных импульсов, обусловленныхтемновым током. Переключатель (8) позволяет уменьшить в 10 раз интенсивностьсигнала, выходящего с ФЭУ. В данной работе сканирование проводят без ослаблениясигнала.После того как прибор отсканирует всю пластинку от места нанесения вещества дофронта элюента (определяется по уменьшению интенсивности сигнала до уровня фона), измерение прекращают: подводят курсор к кнопке «Стоп» на экране монитора инажимают левую клавишу мышки. Одновременно останавливают вращение барабанакнопкой (6) на панели управления сканером.
Выключают высокое напряжение тумблером (4), открывают крышку камеры, вынимают барабан и фиксируют длину про52сканированного участка хроматограммы. Результаты сканирования сохраняют в видедвух файлов: 1) файл с расширением .pgc, который позволяет обрабатывать результаты с помощью программы Power Graph; 2) файл с расширением .txt, представляющийсобой массив данных. Для уменьшения объема регистрируемых данных можно использовать 10-кратную регрессию.
Количество точек фиксации данных уменьшаетсяв 10 раз, но это, как правило, не уменьшает точность определения радиоактивности.Правила работы с веществами, содержащими14СУглерод-14 постоянно образуется в атмосфере Земли под действием космическогоизлучения по реакции 14N(n,p)14C.
Поэтому в живых организмах поддерживается постоянное соотношение изотопов 14С:12С ≅ 1: 1012. В организме взрослого человека содержится примерно 4 кБк 14С. Примерно такое же количество изотопа будет наноситься на хроматографическую пластинку при выполнении настоящей работы.Углерод-14 является мягким β-излучателем. Максимальный пробег β-частиц 14Ссоставляет 31 мг/см2, и излучение углерода-14 полностью поглощает слой воздуха 25см или стенки пробирок с радиоактивными растворами. В случае попадания 14Свнутрь организма его основная часть достаточно быстро выводится через легкие вформе 14СО2.
Однако некоторое количество этого долгоживущего изотопа (Т1/2 = 5600лет) может оказаться в составе молекул белков и нуклеиновых кислот.Правила работы с радиоактивными веществами могут отличаться некоторыми деталями в зависимости от характера операций, используемого изотопа и его количества. Однако есть общие требования, которые необходимо неукоснительно соблюдатьпри проведении любого исследования с радиоактивными препаратами в открытомвиде.
Применительно к выполнению данной работы эти требования таковы. Все операции с радиоактивными растворами и пластинками проводят над кюветами, в халатеи в перчатках. Пробы отбирают специальными пипетками и капиллярами. Использованные наконечники пипеток и капилляры помещают в стаканы для радиоактивныхотходов. После завершения работы проверяют (с помощью находящегося в комнатерадиометра) радиохимическую чистоту халата, перчаток и рук.
Проверяют степеньзагрязненности поверхности кюветы. Для этого измеряют радиоактивность взятого«мазка» с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра или радиометра(см. работу 5). При нештатной ситуации (загрязнение радиоактивным веществом кожи рук, одежды, поверхности стола и т.п.) немедленно обращаются к преподавателюи под его руководством проводят дезактивацию.Цель работыОпределение радиоактивности аминокислот, меченных углеродом-14, в их смеси сиспользованием тонкослойной хроматографии и сканера радиоактивности.Оборудование, материалы и реактивыСканер радиоактивности «БетаХром»;пластинки Silufol; хроматографический стакан; микропипетки, капилляры.растворы аминокислот: лизин (К), глицин (G), валин (V), лейцин (L);смеси этих аминокислот, меченных 14С;раствор нингидрина в ацетоне или этаноле;бутанол, уксусная кислота (98%), дистиллированная вода;сцинтилляционная жидкость Scintilene BD.53Выполнение работыГотовят элюент для хроматографии, смешивая бутанол, уксусную кислоту и дистиллированную воду в отношении 3:1:1 по объему.
Вдоль внутренней стенки хроматографического стакана размещают фильтровальную бумагу. Аккуратно наливают встакан приготовленный элюент в количестве, достаточном для погружения в негохроматографической пластики примерно на 0,5 см. Фильтровальную бумагу рекомендуется смочить элюентом, что должно привести к более быстрому подъему элюентапо пластинке и повысить воспроизводимость результатов.
Стакан закрывают стеклянной крышкой.Отрезают нижний край хроматографической пластинки шириной около 1 см и расчерчивают пластинку по образцу, приведенному на рис. 7.2. Стартовую линию проводят на расстоянии 10-12 мм от нижнего края пластинки, стараясь не нарушить слойсорбента. Вертикальные разделительные линии прочерчивают скальпелем, чтобыудалить слой сорбента. Ширина полосок примерно15 мм. В верхней части пластинкиобозначают аминокислоты-стандарты и номер смеси меченых аминокислот, выданных для анализа.С помощью капилляра или микропипетки наносят на линию старта 1-2 капли растворов аминокислот-стандартов. Надевают перчатки. Переносят хроматографическуюKGVL№4положениеаминокислотына пластинкеlLлиния фронтастартовая линиястандарты аминокислот радиоактивнаясмесьРис.
7.2. Вид хроматографической пластинки, используемой в работе.Пояснения в тексте.пластинку на кювету с радиоактивными растворами. Надевают на микропипеткусменную насадку, отбирают 2 мкл раствора смеси аминокислот и аккуратно наносят54раствор на линию старта. После высыхания раствора наносят еще 2 мкл раствора.Сменную насадку снимают с пипетки и кладут в емкость для радиоактивных отходов.0,0050,004пики радиоактивности0,0030,0020,001фоновые линии дляобсчета пиковS3S2S10012345678910 11смРис.
7.3. Распределение радиоактивности по хроматографической пластинке, полученное из данных сканирования. Радиоактивность меченых соединений пропорциональна площади пиков S1, S2 и S3.Хроматографическую пластинку с нанесенными стандартами и радиоактивнойсмесью аминокислот ставят в хроматографический стакан. После этого можно снятьперчатки, так как дальнейшие операции с хроматографической пластинкой не представляют опасности из-за низкого уровня радиоактивности на ней.Через 30-40 минут, когда элюент поднимется по хроматографической пластинкепримерно на 10 см, пластинку извлекают из хроматографического стакана, карандашом отмечают линию фронта элюента и высушивают.
Ножницами отрезают полоску,на которой проводили разделение смеси меченых аминокислот. Полоски со стандартами аминокислот опрыскивают раствором нингидрина или наносят раствор нингидрина на полоски с помощью пипетки. Пластинку, обработанную раствором нингидрина, оставляют при комнатной температуре до появления фиолетовых и краснофиолетовых пятен – продуктов реакции нингидрина с аминокислотами. Для ускорения проявления пятен пластинку можно нагреть под лампой или в сушильном шкафу.При этом необходимо следить за пластинкой, так как при «перегреве» нингидрин может окрасить всю пластинку. Контуры полученных пятен обводят карандашом, а слойсорбента заклеивают скотчем для того, чтобы можно было брать пластинку в руки безопасения испачкаться нингидрином.Внимание! Нингидрин вступает в реакцию с аминокислотами, входящими в состав белков кожи, окрашивая руки в красно-фиолетовый цвет.
Рекомендуется выполнять операции с растворами нингидрина в перчатках.55Готовят ленту скотча, размер которой чуть больше длины хроматографическойпластинки. С помощью пипетки наносят 0,10÷0,15 мл сцинтилляционной жидкостиScintilene BD на пластинку с радиоактивностью таким образом, чтобы жидкость равномерно пропитала слой сорбента от старта до фронта хроматограммы. Аккуратноприкладывают полоску сорбентом к липкой стороне ленты скотча, заворачивают оставшиеся части ленты вокруг хроматограммы.
Образованный скотчем футляр не позволяет испаряться сцинтилляционной жидкости и делает дальнейшую работу с хроматограммой безопасной.Под руководством преподавателя проводят сканирование хроматограммы на приборе «БетаХром». Данные сканирования записывают в виде текстового файла с 10кратной регрессией.На хроматограммах стандартов определяют Rf аминокислот как отношение Rf = l/L,где l – расстояние от стартовой линии до центра пятна соответствующей аминокислоты; L – расстояние от стартовой линии до фронта элюента (см. рис. 7.2). С помощьюMicrosoft Excel или любой другой программы по математической обработке данныхстроят графики зависимости интенсивности сигнала от положения детектора над пластинкой (рис. 7.3). Так как программа Power Graph фиксирует время сканирования, тонеобходимо преобразовать время в расстояние с помощью коэффициента, определяемого делением длины отсканированной части хроматограммы на время сканирования.Определяют фоновую линию на графике, исходя из интенсивности сигнала до стартовой линии и выше фронта элюента.
В идеале фоновые значения сигнала должныбыть постоянны во всем интервале сканирования. Однако часто наблюдается слабыйдрейф фоновой линии, связанный с тем, что сканирование начали, не дождавшись,после включения высокого напряжения, выхода ФЭУ на стабильный режим работы.В этом случае требуется экстраполяция фоновой линии некоторой функцией, что поможет точнее определить площади пиков на графике.
На полученном графике идентифицируют пики радиоактивности аминокислот (по величинам Rf) и определяютплощади пиков, суммируя значения интенсивности сигнала в пределах пика за вычетом фона, определяемого по огибающей (см. рис. 7.3). Рассчитывают процентное соотношение радиоактивностей аминокислот, находящихся в исследуемой смеси:SX%(X) =⋅100%(7.1),∑ S X, iiгде SX – площадь пика аминокислоты X; ∑ S X, i – сумма площадей пиков всех аминокисiлот, идентифицированных на хроматограмме.56РАБОТА 8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕГИСТРАЦИИ ТРИТИЯ ИУГЛЕРОДА-14 ПО СПЕКТРАМ, ПОЛУЧЕННЫМ С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОСТНОСЦИНТИЛЛЯЦИОННОГО СПЕКТРОМЕТРАВ настоящее время в научных исследованиях в области химии и биохимии широкоиспользуются соединения, меченные тритием и углеродом-14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
