О.И. Епифанова - Лекции о клеточном цикле (1129781), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Благодаря своей простоте, универсальная модель снискала на первых порах немало приверженцев. Однако постепенно выяснилось, что ни одно из ее основных требований не соответствует результатам, полученным на клетках высших эукариотов. Помимо частных противоречий, подробно рассмотренных в более ранних публикациях (Епифанова и др., ! 988), существенным недостатком модели является невозможность объяснить с ее позиций избирательную активацию отдельных метаболических процессов при переходе клеток в состояние покоя, в первую очередь, синтез новых специфических белков (см.
главу )У), Кроме того, как теперь стало известно, именно в митозе, которому Купер отводил роль лишь завершающего этапа в процессе деления клетки, начинается активация МАР-киназ для следующего клеточного цикла, а также преобразование и транспорт при участии веретена деления некоторых ключевых белков-регуляторов. Наконец, переход клеток к репликации ДНК, который Купер связывал с повышением до необходимого уровня внутриклеточной концентрации инициатора, то есть эндогенного стимулятора пролиферации, можно в равной мере объяснить снижением концентрации эндогенного ингибнтора пролиферации.
Иными словами, правомерно представить себе по меньшей мере два типа эндогенного контроля вступления покоящихся клеток в цикл: позитивный и негативный. Проверка этого допущения была осуществлена в опытах с применением метода клеточной гибридизации. Изучение эндогеиной регуляции размножения клеток методом клеточной гибридизации Автор метода клеточной гибридизации — английский исследователь Харрис (Нагпз, 19б5).
Слияние клеток осуществляется чаще всего с помощью инактивированного вируса Сендай или поверхностно-активных соединений, таких как полиэтиленгликоль. Используется также электрический разряд. Подробные сведения об этом можно почерпнуть в монографии Зеленина и соавторов «Реконструированная клетка» (1982). Для того, чтобы выяснить, какой тип эндогенного контроля пролиферации клеток (позитивный или негативный) имеет место в действительности, анализируют способность к вступлению в период синтеза ДНК ядер гетерокарионов, полученных в результате слияния пролиферирующих и покоящихся клеток. При этом, как правило, используют в качестве покоящихся клетки, культивируемые в условиях низкого содержания сыворотки в среде, а в качестве пролиферирующих — клетки, стимулированные сывороткой и проходящие период Оп но еще не приступившие к синтезу ДНК.
Предполагается, что в случае позитивного типа контроля ядра покоящихся клеток в таких гетерокарионах должны вступать в клеточный цикл и в дальнейшем си нтези ровать ДН К под влиянием предполагаемого сти мулятора, вырабатываемого пролиферирующими клетками. В противоположность этому, при негативном типе контроля ядра стимулированных клеток в гетерокарионах должны переходить в состояние покоя под влиянием ингибиторов, присутствующих в покоящихся клетках (рис.
33). Важным аспектом при проведении опытов по слиянию пролиферирующих и покоящихся клеток служит способ идентификации их ядер в гетерокарионах, поскольку морфологически они не отличаются друг от друга. С этой целью производится предварительное маркирование ядер до слияния. ПОЗИТИВНЫЙ внутри кяетогимй стимулятор НЕГАТИВНЫЙ ° Ф ° ° ° ° — ~ ° внугрииямочимй ° ° Ф иигибитор Рис.33. Возможные пути эндогенного контроля размноженил клеток. К вЂ” покоящиеся клетки, Р— пролиферирующне клетки.
На рис. 34А воспроизведена в качестве иллюстрации схема опыта по слиянию пролиферирующих н покоящихся фибробластов мыши с помощью полиэтиленгликоля (Сетков и др., 1984). Покоящиеся клетки (К) получали путем инкубации клеток в течение трех суток в среде с низким содержанием сыворотки, предварительно пометив их в экспоненциальной фазе роста нС- тимидином, а пролиферирующие (Р) клетки получали путем добавления среды с 10% сыворотки, оставляя их немечеными; при этом использовали клетки на всем протяжении пререпликативного периода. После слияния клетки инкубировали в течение 1б час в среде с 'Н-тимидином, с целью проследить за вступлением ядер в В-период.
Методом радиоавтографии с использованием двойного изотопного маркирования (см. Епифанова и др., 1977) на препаратах можно идентифицировать (рис. 34Б) различные ядра как в исходных клетках — монокарионах (К и Р), так и в продуктах слияния: гомокарнонах (К х К и Р х Р) и гетерокарионах (К х Р).
Сопоставляя данные по включению 'Н-тимидина в ядра гетерокарионов с данными по его включению в ядра моно- и гомокарионов в динамике, можно судить о взаимном влиянии ядер пролиферирующих и покоящихся клеток на прохождение ими клеточного цикла и вступление в Я-период. Для идентификации продуктов слияния клеток и ихдальнейшего изучения применяют и другие способы, например, пред- 10% сыворотки А '"Сфимидин ПЗГ 015% 0,5 или 10% сыворотки 'Н-тамилин Фиксаиив клеток( Х ~ 1ачас Слидри~ 1Овтв 1ПрврвпвмввтввнвЩ1 1 период дни Гетерокарвон '4С-тимидин 4Ф Гомодикармонм Рнс.
34. Схема опытов по слиянию клеток линии Х1Н ЗТЗ (А). ПЭà — пализтиленгликоль, От — состояние покоя, Б — пернодсинтезвДНК, К вЂ” покоящиеся клетки„Р— пролифернрующие клетки. Идентификация исходных клеток н продуктов слияния (Б). К вЂ” покоящиеся клетки, Р— пролиферирующие клетки, Х вЂ” знак слияния клеток. Рис. 35. Автограф культуры фибробластов мыши Х1Н ЗТЗ после слияния с лейкемическнми клетками человека Н1 60. Для идентификации продуктов слияния клетки Н1.60 были предварительно помечены 'Н-тнмндином (зерна серебра) с последующим иммуногнстохимнческим выявлением синтеза ДНК в ядрах по включению бромдезоксиурндина. Автограф любезно предоставлен И.А.Прудовским.
!в включение 'Н-тимидинб 2 — включение бромдезоксиуридина. варительное маркирование ядер 'Н-тимидином с последующим выявлением их способности синтезировать ДНК методом иммуногистохимии при использовании бромдезоксиуридина (рис. 35) (Ргибоузйу, Тзопй, 1991). В первых же опытах, проведенных независимо в нескольких лабораториях на культуре диплоидных фибробластов человека (ВаЬ(псу!гс)з, Хопчоог$, 1980; Вте(п, Уап(з(геуз1су, 1981) и культуре фибробластов мыши Х1Н ЗТЗ (Ро!ипоуз(гу ес а1., 1983), были получены однозначные данные в пользу негативного типа зндогенного контроля вступления клетки в митотический цикл. Когда в одном гетерокарионе в общей цитоплазме оказывалось ядро пролиферирую щей (стимулированной) клетки и ядро покоящейся клетки, ядро пролиферирующей клетки утрачивало способность синтезировать ДНК (рис.
36А). В то же время присутствие в гетерокарионе пролиферирующей клетки не индуцировало вступления покоящейся клетки в Я-период (рис. 36Б). 60 СО и ,е 28 О 2 С 6 8 16 12 1С 16 % смворотии перед слиянием, час о. е и в 28 й в и аа О 2 О 2 14 6 8 етЬ смворотии перед спиянием, час Рис.36. Результаты опытов пс слиянию прслифсрирующнх (Р) и покоящихся (К) клеток Х1НЗТЗ. Схема опыта и идентификации клеток представлены на рис. 34. А — включение 'Н-тимилина в ядра Р-клеток после слиянии с К-клетками; Б — включение 'Н-тимилина в ядра К- клеток после слияния с Р-клетками. Дальнейшие исследования (Ро!цпоузйу ег а1., 1983) показали, что предварительная обработка покоящихся клеток в течение 4 час ингибитором синтеза белка — циклогексимидом устраняет их тормозящее влияние на пролиферирующие клетки в гетерокарионах, что подтверждало предположение о способности покоящихся клеток вырабатывать ингибитор пролиферации.
Отсюда вытекало следующее заключение, а именно, что необходимым условием приобретения покоящимися рппр рир ебр юС у И «фЯ Х менее а Пвегвесеня ~~Я Я Пререпвпкатпвный период Рис.37. Схема, иллюстрирующая предположение о тоы, что состояние компетентности клетоклля вступления в митотический цикл может быть индуцировано не только Факторами роста.
но также путем подавления синтеза белка. К вЂ” состояние покоя„Б — период синтеза ДНК. РРОР, РОР— факторы компетентности; ЕОР, ЯтС вЂ” факторы прогрессии; СН вЂ” цихлогексимид. клетками компетентности для осуществления пререпликативных реакций (см. главу у) должно служить снижение внутри- клеточного уровня эндогенного ингибитора„которое можно вызвать не только путем воздействия на клетки тем или иным фактором роста (митогеном), но и с помощью циклогексимнда, подавляя образование ингибитора пролиферации (рис. 37).
Экспериментальная проверка этого предположения методом клеточной кинетики (Розенвальд и др., 1989) показала, что даже кратковременная обработка покоящихся клеток )ч(Н ЗТЗ циклогексимидом в течение 45 мин без дополнительного воздействия фактором прогрессии (ЕОР) стимулирует их вступление в Я-период. Короткоживущие белки — репрессоры пролиферации клеток Полученные результаты побудили к проведению сравнительного исследования внутриклеточных процессов, протекающих при воздействии на клетку, с одной стороны, факторов роста, а с другой стороны — ингнбнторов синтеза белка. С этой целью была изучена методом блотгибридизации мРНК с ДНК- пробами экспрессия ранних протоонкогенов (гоз, уип и опус) в покоящихся при низком содержании сыворотки фибробластах Рис.
38. Сопоставленнедействия Р(3ОР н циклогексимида на экспрессию «ранних» протоонкогенов в покоящихся клетках Х!Н 3ТЗ (по данным Розенвальда и др.). Результаты блотгибрндизации мРНК покоящихся клеток (0,5% сыворотки в течение 3 дней) с ДНК-пробамн с-уил с-тус, с-уоа н с-/ил прн воздействии РРОР в течение 12 ч (А) и кратковф 1~й ф~~фффЯ~ контрольременной инкубацнн с циклогек- снмидом (!О мг/мл) в течение 1О Б мин, 45 мнн н 4 ч (Б); контроль— экспрессия мРНК гена тубулина. СН - 10 ннн СН - 45 мнн СН-4ч с" 0 0,8 2 8 !2 0 0,5'2 8 12 0 0,5 2 8 с-тис с-Гол с-уил контроль мыши, подвергнутых действию РПОР, циклогексимида и пуромицина (Козептиа!б е! а!., 1995).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
