Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 131
Текст из файла (страница 131)
7.20, три разные специфичности связывания с ДНК, в принципе, могут быть сформированы из двух типов мономеров «лейциновой молнии», тогда как шесть — из трех типов мономеров и т.д. Рис. 7.«0. Гетеродимеризвция белков, содержащих клейциновую молнию», может изменить специЕичность связывания с ДНК. Гомодимеры «лейциновой молнии» связываются с симметричными последовательностями ДНК, кзк зто изображено слева и по центру.
Эти двз белка узнают различные последовательности ДН К, обо»печенные кросными и голубымн участками нз ДНК. Двз разных мономерз могут объединяться и обрззовывзть гетеродимер, который узнает уже гибридную последовательность ДНК, состоящую из одного красного и одного голубого участка. Однако при таком беспорядочном сочетании белков действуют и ограничения. Например, если бы в обычной эукариотической клетке все типы белков с «лейцино вой молнией» образовывали гетеродимсры, то количество «взаимных помех» между цепями, регулирующими экспрессию генов в клетке, бьгло бы, вероятно, настолько огромным, что вызвало бы хаос.
Возможность образования определенного гтггсро димсра зависит от того, как хорошо гндрофобные поверхности двух «лейциновых молний» сцепляются друг с другом, что, в свою очередь, зависит от конкретных ами нокислотных последовательностей двух областей этих «застежек». Таким образом, в клетке каждый белок, содержащий «лейциновую молшпо», может образовывать днмеры только с небольшим набором других белков с аналогичным мотивом. Гетеродимсризация является примером комбинаторного контроля (сошЬ1па1опа1 соп(го1), при котором клеточным процессом управляют не отдельные белки, а ком бинации различных белков. Гетеродимсризацня как механизм комбинаторного кон троля экспрессии генов встречается у многих различных видов регуляторных белков (рнс.
7.21). Комбинаторный контроль является ведущей темой, с которой мы будем неоднократно сталкиваться в этой ~лаве, а образование гетеродимерных комплексов, регулирующих активность генов, является только одним нз множества пуп:й, прн котором белки, чтобы контролировать экспрессию генов, действуют совместно. Определенные комбинации рсгуляторных белков стали «намертво» связанными в клетке; например, два разных ДНК связывающихся домена могут посредством Рис. 7.21. Гетеродимер, состоящим из двух гомеодоменных белков, сввзанный со своим участком распознавания ДНК. Желтая спираль 4 правого белка (Мата2) неструктурирована в отсутствие левого белка (мата1) и образует спираль только при гетеродимеризации.
последовательность Днк распознается совместно обоими белками; некоторые из контактов белок-ДНК, образованных Мато2, показаны на рис. 7.13. Два этих белка являются белками почкующихся дронокей, у которых гетероди мер определяет специфический тип клеток (см. рис, 7.65]. Спирали пронумерованы в соответствии с рис 7.13. (Адаптировано из т. Н ет а)., 5оепсе 270: 262-269, 1995.
С разрешения ААА5.) перегруппировки генов, происходящей в ходе эволюции, оказаться соединенными в одну полипсптидную цепочку, которая проявляет уже новую ДНК-связываюшую специфичность (рис. 7.22). Другим важным ДНК-связывающим мотивом, родственным «лсйциновой молнии», является мотив спираль-петля-спираль (НЕН; Ье1(х-!оор-Ье!)х), который отличается от рассмотренного ранее мотива спираль-поворот-спираль н состоит из короткой а-спирали, соединенной при помощи петли со второй более длинной а-спиралью. Гибкость петли позволяет одной спирали загибаться назад и укла дываться напротив другой. Как показано на рпс, 7.23, подобная двуспиральная структура связывается и с ДНК, и с мотивом Н1 Н второго белка.
Второй белок может быть таким же (образуется гомодимср) или иным (образустся гстеродимер). В любом случае две а спирали, которые отходят от области днмсризационного контакта, образуют специфические контакты с ДНК. У некоторых белков с мотивом Н) Н нет а спирального удлинения, ответ ственного за связывания с ДНК. Эти укороченные белки могут образовывать гстеродимсры с белками нормальной длины, содержащими мотив Н) Н, но такие гетсродимсры не способны прочно связываться с ДНК, потому что об разуют только половину необходимых контактов с ней. Таким образом, кроме создания активных димеров, гетеродимсризация является широко используемым клетками способом держать под контролем специфические рсгуляторные белки (рис.
7.24). Рис.7.22.ДваДНК-связывающихдомена, н б' 3' ковалентио соединенные гибким полипептидом. Приведенная структура (называемая Реп-доменом) состоит из гомеодомена и структуры спираль-поворот-спираль, соединенных гибким полипептидным С «поводком», обозначенным пунктирными ы'-м, и линиями Единственный ген кодирует це- 1 ликом весь белок, который синтезируется как непрерывная полипептидная цепь. Ковалентное соединение двух этих структур 4„. подобным образом приводит к значительному увеличению сродства белка к специфической последовательности ДНК по сравнению со сродством любой отдельной части. Группа регуляторных белков млекопитающих, примером которых является эта Зг бг ' Рсш-специфичный структура, регулирует образование факто- домеи ров роста, иммуноглобулинов и других молекул, участвующих в развитии организма Конкретный приведенный пример относится к белку Ост1.
(Адаптировано из 1 О. К)егпгп ет а!., Сел 77: 21-32, 1994. С разрешения Еаеиег) 7.2.13. До сик пор невозможно предсказать последовательности ДНК, распознаваемые всеми регуляторными белками Различные рассмотренные нами г111К связывающие мотивы белков представля ют собой только структурные каркасы, от которых отходят специфические боковые цепи аминокислот и контактируют со специфическими парами оснований ДПК.
Поэтому справедливо задать вопрос, существуег ли простой код распознавания «аминокислота — пара оснований»; всегда ли, например, с нарой оснований С С контактирует определенная боковая цепь аминокислоты? Ответ будет отрицатель ным, хотя определенные типы взаимодействий аминокислота — основание встреча кттся намного чаще, чем другие (рис. 7.25). Как мы видели в главе 3, белковые поверхности практически любой г)юрмы и состава могут быть созданы всего лишь из 20 аминокислот, и регуляторный белок использует разные их комбинации.
чтобы Рис. 7.23. Димер мотива спираль-петля- спираль (Н1Н), связанный с ДНК. Два мономера удерживаются вместе в узле из четырех спиралей: каждый мономер предоставляет по две а-спирали, связанные гибкой петлей белка (красная). Со специфической последовательностью ДНК связываются две а-спирали, высгупающие из четырехспирального узла. (Адаптировано из А. а.
Еегге-ОАгпаге ет ац яГаткге 363; 38-45, 1993. С разрешения Масгпаап риывнегз 11г(.) б58 Часть 2. Основные генетические механизмы с ДНК белков основан на влиянии связавшегося белка на миграцию молекул ДНК в электрическом поле. Молекула ДНК обладает высоким отрицательным зарядом и, следовательно, в электрическом поле быстро движется к положительному электроду. При электрофорезе в полиакриламидном геле (см. равд. 8А.З) молекулы ДНК разделяются по размеру, так как меньшие молекулы легче проходят через мелкую сетчатую структуру геля, чем большие.
Молекулы белка, связавшись с ДНК, снижают ее подвижности в геле. В общем, чем больше связавшийся белок, тем медленнее движется связанная с ним молекула ДНК. Это явление лежит в основе метода сдвига электрофоретической подвижности в геле (пе1-шоЪ|11Су зЪ1гС аззау). С помощью этого метода удается обнаружить даже следовые количества сайт-специфического ДНК-связываюшего белка. В короткие фрагменты ДНК, длина и последовательность которых известна (полученные либо при клонировании ДНК, либо путем химического синтеза, обсуждаемого в главе 8), вводят радиоактивную метку и смешивают с экстрактом клеток, полученную смесь наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез.
Если фрагмент ДНК соответствуег области хромосомы, с которой, например, связываются несколько сайт-специфических белков, то при радиоавтографии (см. разд. 9.1.17) видна серия полос ДНК, каждая из них отстает от исходной на разную величину и представляет определенный комплекс ДНК вЂ” белок. Белки, связанные с ДНК в каждой из полос, можно выделить последовательным фракциоиированием клеточного экстракта (рис.
7.27). После очистки сайт-специфического ДН К-связываюшего белка можно использовать метод сдвига электрофоретической подвижности для изучения силы и специфичности его взаимодействия с различнымн последовательностями ДНК, продолжительности жизни комплексов ДНК вЂ” белок и других свойств, важных для функционирования белка в клетке. 7.2.15. ДНК-аффинная хроматография облегчает очистку сайт-специфических ДНК-связывающих белков После определения распознаваемой регуляторным белком последовательности ДНК можно использовать чрезвычайно действенный метод очистки белка, называемый ДНК-аффинной хроматографией (121ЧА-айвп1Су еЪгошаСопгарЪу). Химически синтезированный двухцепочечный олигонуклеотид соответствующей последовательности пришивают к нерастворимой пористой матрице, например агарозе, а затем этой модифицированной матрицей заполняют колонку, которая селективно связывает белки, узнаюшие определенные последовательности ДНК (рис.
7.28). Этот относительно нетрудоемкий метод позволяет добиться 10000-кратной очистки. Большинство регуляторных белков присутствует в клетке в очень маленьких концентрациях, но используя аффинную хроматографию, обычно можно выделить такие количества чистого белка, которых будет достаточно для того, чтобы определить масс-спектроскопией или другими методами (описаны в главе 8) его частичную аминокислотную последовательность.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
