Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 132
Текст из файла (страница 132)
Если известна полная последовательность генома организма, то частичная аминокислотная последовательность может быть использована для идентификации гена. А ген предоставляет не только информацию о полной аминокислотной последовательности белка, но также и возможность его синтеза в неограниченных количествах методами генной инженерии, которые рассмотрены в главе 8.
радиоактивныи РаДиоактивный фрвпяент ДНК фрагмент ДНК + клеточный экстракт сь Ь х о В сг хю Эемз)ф„: — С1 (г)()(швп ",' С2 зйтрг))(г',( — Сб ':«Звгэй';.':.;,"; СЗ ям я((вчг — СВ ав(()(г())':,.:~-' —.ДНК б з бе в а) результаты апектрофореза 10 20 30 40 номер фракции, алюированной с хроматографичвской колонки при возрастающей концентрации соли Рис. 7.27. Метод сдвига злектрофоретической подвижности. Принцип метода изображен на схеме а. В этом примере экстракт, полученный из линии антител-продуцирующих клеток, смешивали с радиоактивно-меченым фрагментом ДНК, содержащим около 160 нуклеотидов регуляторной последовательности гена, кодирующего легкую цепь иммуноглобулина, продуцируемого этой клеточной линией, Воздействие белков, входящих в состав экстракта, на подвижность фрагмента ДНК определяли методом электрофореэа в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией, Свободные фрагменты ДНК быстро мигрируют к концу геля, тогда как те же фрагменты, связанные с белками, задерживаются.
Обнаружение шести отстающих полос ДНК указывает на присутствие в экстракте шести различных сайт-специфических ДНК-связывающих белков (обозначенных С1 — Сб), которые связываются с этим фрагментом ДНК Для простоты все фрагменты ДНК, с которыми связываются более одного белка, на рисунке не показаны) На схеме б экстракты фракционировали по стандартной методике хроматографического разделения белков (см.
равд 8.2.3) (вверху), каждую фракцию смешивали с радиоактивным фрагментом ДНК, наносили на одну дорожку полиакриламидного геля и анализировали далее, как указано на схеме а. (б — с модификациями нз С 5све)г(егей, А. Небцу апг( К.6. Крейг, Сей 51: 783 — 793, 1987. С разрешения Ейегдег.) 7.2. 16. Ра«познаааемунг регупиторным бенком поснеДоаатеп(зность ДНК можно устаноанть экспериментально Обнаружить рщуляторныс белки можно и до того, как станет известна по слсдователыюсть ДНК, которую они распознают. Например, множество гомсодо менных белков дрозофилы открыли при селекции мутаций, влиякнцих на развитие мухи, что позволило определить гены, кодируюп(ие зти белки, а затем получить необходимые количества этих белков сверхзкспрессисй в культуре клеток и легко 7.2.ДНК-связывающие мотивы в белках, регулирующих экспрессию генов 661 белок препятствует действию нуклеаз на фосфодиэфирные связи, таким образом, точный участок узнавания белком выявляется в виде защищенной зоны, или футпринта — «отпечатка ноги» (рис.
7.29). Для второго способа определения распознаваемой регуляторным белком последовательности ДНК не требуется предварительных данных о том, какие гены этот белок, быть может, регулирует. В данном случае очищенный белок используют для отбора из большого пула различных случайно созданных коротких фрагментов ДНК только тех, которые прочно с ним связываются. После нескольких циклов такого отбора определяют нуклеотидную последовательность прочно связавшихся с белком фрагментов ДНК, и тогда может быть сформулирована консенсусная последовательность ДН К, которую распознает данный регуляторный белок (рис.
7.30). Как только она становится известна, то при помощи автоматизированного поиска по геному можно определить вероятные гены, транскрипцию которых, возможно, контролирует интересующий регуляторный белок. Однако эту стратегию не стоит считать абсолютно надежной. Например, у многих организмов синтезируется ряд близкородственных регуляторных белков, которые распознают очень схожие последовательности ДНК, но данным методом их нельзя различить. В большинстве случаев полученные в ходе перебора геномных последовательностей предполагае мые участки действия регуляторных белков должны в конечном итоге проходить экспериментальную проверку. 7.2.17. Регуляторные последовательности ДНК определяют, используя сравнительную геномику, методом филогенетического футпринтинга Широкая доступность полных последовательностей генома предоставляет уди вительно простой метод определения важных регуляторных участков ДНК, даже если регуляторный белок, который с ними связывается, неизвестен.
Этот метод заключается в сравнении геномов нескольких близкородственных видов. Если виды правильно подобраны, то кодируюшие белки части генома будут очень схожими, но области между последовательностями, кодирующими белки или молекулы РНК, будут значительно различаться, так как большинство этих последовательностей не являются функционально важными и поэтому изменяются в ходе эволюции. Среди исключений находятся регуляторные последовательности, которые контроли руют транскрипцию генов. Они выступают как консервативные островки в океане неконсервативных нуклеотидов (рис.
7.3(). Хотя идентификацию регуляторных белков, распознающих консервативные последовательности ДНК, следует проводить другими способами, тем не менее филогенетический футпринтинг является мощным методом определения многих последовательностей ДНК, контролирующих экспрессию генов. 7.2.18. Методом иммунопреципитации хроматина определяют многие участки ДНК, занимаемые регуляторными белками в живых клетках В определенный момент времени регуляторный белок не будет занимать в геноме все возможные для него участки связывания на ДНК.
При некоторых обстоятельствах белок может быть не синтезирован и поэтому его не будет в клетке; он может быть в клетке, но у него не будет партнера для образования гетеродиме- а) участок ДНК, защищенный ДНК-связывающим белком бг 3 3 б' СЛУЧАЙНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ семейство молекул одноцепочечной ДНК, меченых по бсконцу РАЗДЕЛЕНИЕ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ футпринт, где нв наблквщвтся расщепления с белком футпринт Рис. 7.29.
Метод фугпринтинга ДНК. а) Схема метода. В один из концов ДНК-фрагмента вводят радиоактивнуюю метку зтР (процедура описана на рис. 8 34) и затем меченый фрагмент расщепляют с помощью нуклеавы или химического соединения, вводя случайные одноцепочечные разрывы. После проведения де натура ции ДН К и разделения ее на отдельные цепи фрагменты, которые образуются из меченой цепи, разделяют на геле и детектируют с помощью радиоавтографии (см. Рис. 8.33).
После этого сравнивают расположение полос ДНК, образуемых в присутствии и отсутствии ДНК-связывающих белков. При наличии такого белка он прикрывает нуклеотиды на участке связывания и защищает их фосфодиэфирные связи от расщепления. В результате меченые фрагменты, которые содержат участок связывания, отсутствуют, и на геле возникает пробел, именуемый футпринт. В приведенном примере ДНК-связывающий белок защищает семь фосфодиэфирных связей от действия расщепляющего агента.
б) Реальный фугпринт, использованный для определения участка связывания регуляторного белка человека. В качестве расщепляющего агента использовали низкомолекулярное железосодержащее органическое соединение, которое в норме расщепляет любую из фосфодизфирных связей с практически равной частотой. (б— с любезного разрешения МКЬе(е 5ашаг)ойо и йаЬегт йоедес) о ЧйННО йнйй ЧС фнО Счч , ° ",Д',О а асс чночч ооонн ~~ ОЗо ы.б33 ййййо ООООН ~1Е3 нннон О ОО Н Н Н О О О Оо н3233 3313й $Ф1!~ ООСО нон о ннноо , о '' ,',б', Яф 3.- чная 3Цц Он|ВВВ вв а с С С О . Ф с да с Ф р ч т в О х т ~ ю ~ а ФФХ с да нв а х О О х х о о с н Х о в О С Ф д н х а ас И хна х Е Й.
сГс в х д Д Ф Ф в ФФ5 ч о ч л $ 5нс о о с с т ~да а Ф Ю х о Ф д н а а д т'в Ф- ад о с о вс О л л а д х д о х а н т с с х л с х Ф х ох х ах Ы хОс~ д а с т О|О а т Ф ю а с т с о с т в с м а м х т „.~Ь с в ЕУ Ф Ф а Ф т в Е о х т Ф н а О о х х с в Ю Ф х с а о с о х Ь О Р н т о 3. в д Б 'Я а Я а ч о щ в "' 4 о ~н "о Ф я а 2 л д а Ф а о о Ф с Ф Ф а о т с Ф % о д о д с ч а ф о а л о Ь а ~ с 1О Х О н х 1 с н а н а в х х а а О Ф л Ф а а с в Ф н т т О.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
